[发明专利]利用体外定量溶血分光光度法检测抗体生成细胞的方法

说明书

本发明公开了利用体外定量溶血分光光度法检测抗体生成细胞的方法，包括以下步骤：1)取细胞培养板，空白组每孔加入猪脾脏淋巴细胞悬液和生理盐水；试验组每孔加入猪脾脏淋巴细胞悬液、生理盐水和SRBC悬液，培养72~84 h；2）各孔分别加入致敏SRBC悬液，继续培养1~2 h后，离心，各孔取500体积份上清液放置于另一细胞培养板中，采用酶标仪测定各孔上清液在415 nm波长处的吸光度，记为OD_415nm；3）实验结果以抗体生成细胞阳性率A表示，A=[（试验组OD_415nm均值/空白组OD_415nm均值）‑1]×100%。本发明方法在细胞上展现，可以排除个体差异，使每个实验组统一至相同水平上，使试验结果更具说服力。本发明方法具有操作简便，周期短，成本低，结果相对稳定等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用体外定量溶血分光光度法检测抗体生成细胞的方法

背景技术

定量溶血分光光度法(Quantitative Hemolysis Spectrophotometry，QHS)又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，可测定由B细胞分泌产生的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白，以光密度(Optical Density，OD)表示，从而反映机体的体液免疫功能，是检测抗体生成细胞的常用方法之一。

现有技术检测抗体生成细胞的方法均在实体动物(小鼠)上检测，检测成本高、周期长且生物体个体差异大，检测结果较不稳定。因此建立一种快速、方便、检验成本低且检验结果相对稳定的抗体生成细胞的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用体外定量溶血分光光度法检测抗体生成细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

利用体外定量溶血分光光度法检测抗体生成细胞的方法，包括以下步骤：

1)取细胞培养板，分为空白组和试验组，每组设置若干个平行孔，其中，空白组每孔加入250体积份猪脾脏淋巴细胞悬液和250体积份生理盐水；试验组每孔加入250体积份猪脾脏淋巴细胞悬液、242.5体积份生理盐水和7.5体积份5～10％SRBC悬液，将细胞培养板培养72～84h；

2)各孔分别加入500体积份0.18-0.22％致敏SRBC悬液，继续培养1～2h后，1500～2500r/min离心5～10min，各孔取500μl上清液放置于另一细胞培养板中，采用酶标仪测定各孔上清液在415nm波长处的吸光度，记为OD_415nm；

3)实验结果以抗体生成细胞阳性率A表示，其中A＝[(试验组OD_415nm均值/空白组OD_415nm均值)-1]×100％。

步骤2)中，所述0.18～0.22％致敏SRBC悬液的制备方法为：将用生理盐水溶解后的补体和积压SRBC按10：1的比例混合，于0-4℃静置20-30min后，加入生理盐水配成0.18-0.22％的致敏SRBC悬液。

进一步，所述积压SRBC的制备方法为：将绵羊静脉血加入等量的阿氏液中，用Hank’s液洗涤细胞，1000-2000r/min离心10-20min，弃去上清液，洗涤3-4次，然后加入Hank’s液重悬沉淀细胞，1500-2500r/min离心10-20min，弃去上清液，沉淀细胞即为积压SRBC细胞。

步骤1)和步骤2)中，细胞培养条件为在37℃、5％CO₂条件下培养。

步骤1)中，所述SRBC悬液的浓度为10％；步骤2)中，所述致敏SRBC悬液的浓度为0.2％。

步骤1)中，所述猪脾脏淋巴细胞悬液的浓度为1.0～2.0×10⁷个细胞/ml猪脾脏淋巴细胞悬液，所述猪脾脏淋巴细胞悬液的制备方法如下：