[发明专利]一种水蛭细胞体外培养基及其培养方法

权利要求书

1.一种水蛭细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将剪碎后的水蛭唾液腺组织块接种于细胞封闭培养瓶中，加入Insect-CCulture 昆虫细胞培养基，25℃细胞培养箱中静置培养60min；

2）配合组织块回收法进行分离培养；

3）通过胰酶消化获得纯化的水蛭体细胞；

步骤1）中水蛭唾液腺组织块通过如下处理方法获得：

a、取水蛭活体在生理盐水中浸泡1h，初步去除体内杂质并最大限度保证其体细胞活力，再用生理盐水清洗其表面粘膜至干净，最后用蒸馏水清洗三遍后置于70%的酒精中浸泡5min，去除体表细菌，用蒸馏水重复多次冲洗去酒精；

b、将步骤a中进行表皮消毒处理后的水蛭转移至超清工作台内，并将其放入盛放有无菌PBS的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪去蛭体两端取头部组织；

c、将步骤b中的头部组织转移到另一个装有PBS缓冲液的无菌培养皿内，浸过蛭体；将头部组织用无菌手术刀剖开头部组织，并在取表皮中间的组织后用无菌PBS缓冲液冲洗；

d、将步骤c中的组织置于75%的酒精内浸泡1min后，取出后用无菌PBS缓冲液漂洗，重复三次；

e、将步骤d中的组织置于盛放有无菌PBS的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪碎成小组织块，并浸泡5min；弃掉漂浮在上部的组织碎屑，得到剪碎后的水蛭唾液腺组织块，剪碎后组织块的大小为1mm³；

所用的Insect-CCulture 昆虫细胞培养基基配方如下：

无机盐：

NaCl1420mg/L，ZnCL₂ 876.54mg/L，MgSO₄·7H₂O1743.48mg/L，KCl2080mg/L，KH2PO₄·2H₂O 1000mg/L；

氨基酸：

DL-丝氨酸9000mg/L，甘氨酸620mg/L，L-精氨酸盐酸盐700mg/L，L-天冬酰胺400mg/L，L-天冬氨酸350mg/L，L-半胱氨酸二盐酸盐160mg/L，L-谷氨酸3500mg/L，L-组氨酸盐酸盐2000mg/L，L-异亮氨酸200mg/L，L-亮氨酸150mg/L，L-赖氨酸盐酸盐850mg/L，L-甲硫氨酸100mg/L，L-苯丙氨酸100mg/L，L-脯氨酸500mg/L，L-苏氨酸200mg/L，L-色氨酸150mg/L，L-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/L，L-缬氨酸200mg/L，ß-丙氨酸400mg/L，L-丙氨酸225mg/L；

维生素：

D-生物素0.15mg/L，D-泛酸钙0.15mg/L，叶酸盐0.15mg/L，氰钴胺0.10mg/L，烟酸0.15mg/L，盐酸吡哆胺0.15mg/L，核黄素0.15mg/L，硫胺素0.10mg/L，对氨基苯甲酸0.15mg/L；

其它：

蔗糖2000mg/L，D-葡萄糖1500mg/L，D-果糖500mg/L，麦芽糖600mg/L，α-酮戊二酸330mg/L，富马酸90mg/L，琥珀酸90mg/L，L-苹果酸90mg/L；

pH用1.0N KOH调节至7.4,使用前加入灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清;

步骤2）中所述组织块回收法的操作过程为：取出步骤1）的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入4-6mL Insect-CCulture 昆虫细胞培养基，覆没组织块，继续原代培养，培养液颜色变深时及时更换新鲜培养液；培养6-12h后，待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液；

所述无菌PBS缓冲液内加入青霉素的含量为600U/mL，链霉素的含量为600U/mL，两性霉素B的含量为15μg/mL；

步骤2）分离培养过程中的 Insect-CCulture 昆虫细胞培养基另加入青霉素的含量为600U/mL，链霉素的含量为600U/mL，两性霉素B的含量为15μg/mL，灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清；

步骤3）所述胰酶消化法为：将步骤2）得到的细胞弃去培养液，经无菌PBS清洗后，加入2mL胰酶消化液，消化50s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，水蛭体细胞已有收缩但未浮起时，立即加入5mL Insect-CCulture 昆虫细胞培养基终止消化，轻轻晃动后弃去培养液，加入4mL PBS液，轻轻洗除残余的成纤维细胞后，加入2mL胰酶消化液，消化3min后，弃去1mL消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入5mLInsect-CCulture 昆虫细胞培养基终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞，利于培养；得到的细胞用八层纱布过滤后接种于含5mL Insect-CCulture 昆虫细胞培养基的25mL培养瓶内，培养温度25℃，培养时间3d。