[发明专利]一种氨基糖苷类抗生素免疫亲和柱及其制备方法和用途

说明书

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种氨基糖苷类抗生素免疫亲和柱及其制备方法和用途，首先将采用环氧氯丙烷活化法活化的琼脂糖凝胶作为载体，然后将基因重组蛋白G偶联到载体上，得到了蛋白G‑sepharose，再将氨基糖苷类抗生素抗体连接到蛋白G‑sepharose上，得到了抗体—蛋白G—sepharose，再用交联剂进行交联，得到了抗体—蛋白G—sepharose填料，最后将抗体—蛋白G—sepharose填料装柱后形成了高纯度和亲和力的氨基糖苷类抗生素免疫亲和柱，充分利用基因重组蛋白G与氨基糖苷类抗生素抗体特异性结合的特点，氨基糖苷类抗生素抗体的Fab片段暴露在外，大幅度提高了基因重组蛋白G的抗体结合能力、氨基糖苷类抗生素的捕捉能力和氨基糖苷类抗生素的纯化效率。

技术领域：

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种氨基糖苷类抗生素免疫亲和柱及其制备方法和用途。

背景技术：

亲和柱是将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在不溶性载体上，制成亲和吸附剂后所装的柱，多用做亲和层析。

氨基糖苷类(AGs)抗生素是由氨基环醇和氨基糖通过氧桥连接而成的苷类化合物,是抑制蛋白质合成、静止期杀菌性抗生素，根据来源，氨基糖苷类抗生素分为天然的和半合成的两种：天然氨基糖苷类抗生素主要为链霉菌(Streptomyces)和小单胞菌(Micromonospora)的次级代谢产物，英文名称后缀一般分别为-mycin和-micin，如庆大霉素(gentamicin)、新霉素(neomycin)及卡那霉素(kanamycin)等，而半合成氨基糖苷类抗生素则是以天然氨基糖苷类抗生素为前体，经结构改造而得的，如阿米卡星、奈替米星、依替米星、异帕米星等。氨基糖苷类药物是一个种类丰富的抗生素类别，因其能防治某些动物性疾病且能促进动物的生长发育，在养殖业中应用广泛。但长期高剂量使用该类药物，会因其降解困难对环境造成危害，并且可通过食物链传递给人。该类药物能够在人体内蓄积，从而产生耳毒性、肾毒性等危害。因AGs残留对动物及人体存在危害，各国对常用的AGs的最大残留限量(maximum residue limit，MRL)都有严格的规定，我国农业部对几种常用的AGs也做出详细的限量规定。

氨基糖苷类的检测方法常用的有微生物法、理化法、HPLC法和酶联免疫吸附分析法：微生物法可以检测所有种类的AGs，并且成本低、操作简单，在残留量的筛选测试中是最佳选择，Cazedey等采用微生物比浊法测定滴眼液中盐酸环丙沙星的含量，检测范围是14.0-56.0μg/mL，随着检测方法研究的深入，微生物法因只能测定生物总效价，不能对主要成分进行定量，且影响因素众多、灵敏度低等缺点而被取代；理化法有毛细管电泳法和薄层色谱(TLC)法，毛细管电泳法是指在高压电场的驱动下，样品通过毛细管实现分离，但是由于其进样量较少，故制备能力较差，毛细管的直径较小，降低了其灵敏度；TLC法是一种色谱分离方法，检测前选择合适的固定相均匀涂布在平板上，然后点样，由于不同成分吸附能力有差别，样品展开后，各成分相互分离,该法操作简单，速度快，同时能够分离多个样品，成本较低，但对于沸点较低的物质，由于其易挥发而不适用；HPLC法因具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，在AGs的检测中得到了广泛的应用，高压即对流动相实施高压以减小阻力，高速即分析的速度比经典色谱快，高效即分离的效能较高，高灵敏度即紫外检测器的灵敏度可达0.01ng；酶联免疫分析(ELISA)法ELISA法是目前AGs残留检测中应用较为广泛的一种免疫学检测方法，主要采用竞争ELISA模式，即酶标抗原或抗体与待测物竞争结合包被在固相载体上的抗体或抗原，加入显色液(可被酶催化而显色的物质)后根据颜色深浅对待测物进行定性和定量。ELISA法以其成本低、灵敏度高、特异性强等优点广泛应用于AGs残留的筛选检测，但该方法也具有稳定性、重复性差，易出现基质效应和交叉反应等缺点。