[发明专利]一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建

说明书

本发明公开了一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建。该方法包括以下步骤：（1）Total RNA的提取；（2）将步骤（1）中提取的Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；（3）将步骤（2）中第一链cDNA作为模板，通过连接酶进行双链接头的连接；（4）将步骤（3）中的连接有双链接头的第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集，得到一种全长双链cDNA。通过该种全长cDNA合成方法得到一种无需进行片段化处理的全长cDNA，构建其测序文库，同时RNA 5’端不完整或者已降解的序列则不会发生此反应，避免了影响后续分析。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建。

背景技术

NGS测序技术又称下一代测序，其优点是测序通量高，周期短，成本低。RNA-seq又称转录组测序技术，即用高通量测序技术把编码RNA、非编码RNA(noncodingRNA)等或把其中的某些RNA的序列测出来，以检测它们的表达水平。通常，在构建RNA测序文库时，首先需要分离纯化相关的RNA样本，然后再将相关的RNA样本进行片段化处理，并通过逆转录合成cDNA，最后通过建库上机进行测序。Iso-Seq又称全长转录组测序，优点是读长长，所测数据基本不需组装，可以直接进行后续相关分析。在cDNA合成过程中，RNA样本无需片段化处理，直接进行全长cDNA的合成。但是由于目前现有的技术和方法无法识别和区分mRNA样本的完整性，对于5’端已降解的mRNA也会进行全合成，最终测得的数据会包含全长的转录本数据和非全长的转录本数据，后续的分析也很难判断其是否为真正意义上的全长。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种全长cDNA合成方法，得到一种全长cDNA，无需片段化处理即可构建测序文库。

本发明提出一种全长cDNA合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）Total RNA的提取；取真核生物的组织、细胞或者血液等样本，进行总RNA的提取。

（2）将步骤（1）中提取的所述Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；第一链cDNA链的合成是在Oligo dT引物以及长链逆转录酶的作用下合成，这一步可以将所有的直链并带有poly A 尾的RNA序列信息进行逆转录并保护起来，逆转录结束后通过过柱纯化维持RNA/cDNA双链的稳定。便于后续连接反应的进行。

（3）将步骤（2）中所述第一链cDNA作为模板，通过连接酶进行双链接头的连接；以第一链cDNA为模板，依据碱基互补配对原理，在特异的连接酶的作用下，使RNA5’端带有帽子结构的G与双链接头的5’凸出末端进行互补配对进行连接。RNA 5’端不完整或者已降解的序列则不会发生此反应。此时杂交双链的两端都带有特异的标签序列，后续基于5’和3’端特异的标签序列，在聚合酶的作用下进行双链cDNA的富集。

（4）将步骤（3）中的连接有双链接头的所述第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集，得到一种全长cDNA。基于5’和3’端特异的标签序列，在聚合酶的作用下进行双链cDNA的富集。该过程中会涉及到PCR循环数的优化过程，在保证非特异，全面扩增的基础上获得足够的cDNA量。此过程中只有5’端带有标签序列的全长cDNA可以进行转化合成双链cDNA，从而获得真正意义上的全长cDNA。

进一步的，步骤（1）中采用Trizol提取方式进行Total RNA的提取。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol的主要成分是苯酚。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。