[发明专利]用于虎斑、拟目与剑尖枪乌贼种间鉴定的分子标记及应用

说明书

本发明涉及一种用于虎斑、拟目与剑尖枪乌贼种间鉴定的分子标记及应用，为属于近缘种鉴定技术，具体的说是一种乌贼近缘物种鉴定的方法。具体为以虎斑、拟目与剑尖枪乌贼基因组DNA为模板，根据虎斑、拟目与剑尖枪乌贼物种基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线(HRM)中的Tm值差异进而区分乌贼物种；采用本发明能够快速、经济、简便的进行物种之间的鉴定，与标签序列测序结果相比较准确率为100％。

技术领域

本发明属于乌贼物种鉴定技术领域，尤其涉及一种可用于虎斑乌贼、拟目乌贼与剑尖枪乌贼种间鉴定的分子标记及应用。

背景技术

虎斑乌贼(Sepia pharaonis)隶属软体动物门(Mollusca)、乌贼目(Sepioidea)、乌贼科(Sepiidae)、乌贼属(Sepia)。分布于印度太平洋的热带海域，自近岸至水深100m的水域中均有发现。拟目乌贼(Sepia lycidas)隶属头足纲(Cephalopoda)、乌贼目(Sepioidea)、乌贼科(Sepiidae)、乌贼属(Sepia)，是浅海暖水性较强的底栖种，栖息在大陆架区15～100m水深的近海水域，分布在印度洋-西太平洋海域。剑尖枪乌贼(Loligoedulis)俗称红鱿鱼,属枪乌贼科,枪乌贼属,浅海性暖水种,分布于东海、南海、日本群岛南部近海,菲律宾群岛至澳大利亚北部海域。东海主要分布在大陆架外缘海域,是20世纪90年代初新开发的头足类资源之一,年产量约(2～3)×10⁴t,是重要的水产品。我国东海水域均有分布这三种乌贼，三种乌贼均有营养丰富、美味可口，广受消费者喜爱。目前，水产品市场上售卖的乌贼多以未冰冻的新鲜死乌贼产品方式和加工方式进行售卖，因为乌贼具有应激喷墨的习性而导致市场上售卖的乌贼因带墨而模糊不清，且死亡后的乌贼种间表型差异缩小，常见的形态学特点差异消失；且加工过后，肢体完整性较差，无法依据局部来进行整体判别。总体而言，依靠形态分类鉴定难度较大，并且易产生很多分歧，单靠形态学难以区分。因此，选用有效的方法来区分虎斑乌贼、拟目乌贼与剑尖枪乌贼具有重要意义；近年来，随着分子生物学的发展，利用分子生物学手段来鉴定物种已经逐渐成为一种趋势，并为大多数的生物学家所接受。自美国学者Lander于1996年提出继RFLP、SSR的第三代新型分子标记技术——SNP以来，SNP的检测和分型已成为遗传学研究的关键技术，SNP指的是某种生物不同个体DNA序列中单个核苷酸点突变产生的多态性，包括置换、颠换、插入或缺失引起的多态现象。SNP是由。而高分辨率熔解曲线法是基于不同核酸物理性质的差异，将荧光染料加入PCR反应体系，当含荧光染料的DNA解旋后，便可收集荧光信息形成熔解曲线。当DNA序列中某个碱基发生变化，熔解曲线便会发生相应的改变，便可通过软件对遗传信息进行分析，其具有高效、精确、高通量、低成本等优点。目前，HRM技术已被应用于已知基因型的鉴定，突变筛查，DNA甲基化分析，微生物的分子分型与鉴定和RNA编辑等领域，是分子诊断中的热门技术。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种可用于虎斑、拟目与剑尖枪乌贼种间鉴定的分子标记。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述分子标记来区分虎斑、拟目与剑尖枪乌贼种间鉴定的应用。

本发明所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述分子标记来区分虎斑、拟目与剑尖枪乌贼种间鉴定的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该可用于虎斑、拟目与剑尖枪乌贼种间鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记的

正向引物F1为5'CTTAGTACAGTTAAAATACCGCAGC 3'；

反向引物F2为5'TAAATAAAGAGTTGGGCCTGCTC 3'。

本发明为解决第二个技术问题提供一种利用上述SNP分子标记在基于高分辩率溶解曲线鉴定虎斑、拟目与剑尖枪乌贼中的应用。