[发明专利]同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT‑PCR检测引物组、试剂盒及其应用。发明人通过设计针对H9与H10亚型AIV HA基因的特异性引物，经过对不同引物组合的筛选得到扩增效果最佳的一个引物组合，然后继续对其引物浓度、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。其特异性和敏感性试验表明该方法只能扩增出H9与H10亚型AIV HA基因，不能检测出其它亚型AIV及常见家禽病原的核酸，最低能检测到量为5×10⁴拷贝/μL质粒模板，另外临床样品的检测结果也表明其与病毒分离结果完全相符。

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科中A型流感病毒属成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)的差异可以将AIV划分为16种不同的HA亚型(H1-H16)和9种不同的NA亚型(N1-N9)。H9亚型AIV自1966年在美国首次被发现，目前已经给全球养禽业造成了十分严重的经济损失。自1998年广东首次发现人感染H9N2亚型AIV病例以来，H9N2型AIV感染人事件也在不断的发生。H10亚型AIV主要在北美地区的鸡、火鸡、野鸟及南非地区的鸭中分离到病毒，近年来在我国华南地区的环境及家禽拭子样品中也有分离到H10亚型禽流感毒株的报道。在之前的2004年和2010年，埃及和澳大利亚分别出现H10亚型AIV感染人事件。自2013年12月以来，中国先后发生3例人感染H10N8亚型禽流感病毒的病例并造成其中2例死亡，这是世界上首次报道H10亚型流感病毒感染人并致死的病例。近年来的低致病性禽流感的流行病学的监测中发现H9和H10亚型禽流感病毒混合感染普遍存在，研究还表明感染人的H10N8亚型流感病毒的部分内部基因来源于H9N2亚型AIV。因此，H9与H10亚型AIV对家禽养殖及人类健康卫生具有重要意义。

由于经典的病毒分离鉴定方法存在检测鉴定周期较长的缺点，而常用的血清学方法则需要较多标准阳性血清且不同亚型血清之间存在不同程度的交叉反应，具有一定的局限性，所以目前检测禽流感病毒主要是采用分子生物学方法。分子生物学特别是PCR检测方法具有操作简便、特异性好、敏感性高等优点，在禽流感病毒的监测和诊断过程中得到了广泛的应用。由于AIV混合感染普遍存在且具有相似的临床症状，难以及时准确的对其进行鉴别区分。

近年来多重PCR技术在禽流感诊断中的应用越来越多，但关于H9与H10亚型AIV混合感染的多重PCR检测方法还见报道。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用，建立一种可同时检测H9与H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法，不仅可以快速准确的鉴别两种不同亚型AIV，也为感染人的AIV病原学监测提供技术支撑，具有十分重要的公共卫生意义。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对H9-F和H9-R、引物对H10-F和H10-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.4所示的序列。