[发明专利]桥接蛋白及其复合物的制备和应用

说明书

本发明公开了一种桥接蛋白，其用于示踪剂和生物大分子之间的连接。该分子桥接了示踪剂和生物大分子，①避免了示踪剂与生物大分子直接偶联时破坏生物大分子的活性；②示踪剂偶联无需连接在微球上，以避免微球在液相反应中聚集沉淀所导致的结合效率低，检测能力受限的缺陷；③桥接蛋白中的赖氨酸为示踪剂偶联提供了充足的结合位点，以提高检测的灵敏性；④桥接蛋白能与生物大分子特异性结合，无需化学处理，以便更好地保持生物大分子的活性；5)桥接蛋白的荧光能够实时显示示踪剂偶联过程中的蛋白变性状态。

技术领域

本发明涉及时间分辨荧光分析领域，具体涉及一种应用于时间分辨荧光分析中的桥接蛋白及其复合物的制备和应用。

背景技术

时间分辨荧光分析法(Time-resolved Fluoroimmunoassy，TrFIA)是利用镧系元素螯合物标记抗原、抗体、多肽、激素等，发生如抗原/抗体免疫反应、生物素/亲和素反应等反应后，加入增强液解离镧系元素，使其荧光信号得到加强，再经外源性脉冲光激发，并采用延时读取等光电技术检测镧系元素的特异荧光，从而达到对样品分析检测的目的。由于发光物质铕离子和螯合剂结合后与包被的抗原或抗体进行免疫反应，形成的抗原-抗体-铕标记物复合物在弱碱性缓冲液中经激发光激发所发生的荧光信号甚弱，须加入增强液(β-酮体、TOPO、Triton X-100、pH2-3的醋酸和邻苯酸氢钾的酸性溶液)，使稀土离子从络合物上离下来，与新的络合物结合形成大分子的微囊，这种微囊将能量传递给Eu³⁺，阻断水所产生的淬灭效应，使原来的荧光信号增强近100万倍，利于荧光测量。

在传统的时间分辨荧光分析法中，需要解离和增强，增强液是不可或缺的，且对增强液纯度要求很高。增强液的纯度影响增强液的荧光本底，从而影响检测灵敏度。

目前，在时间分辨荧光分析法中研究较多的如申请公布号为CN104634961A的中国发明专利，其利用聚苯乙烯将磺酰氯螯合剂(BHHCT)与稀土元素复合形成荧光复合微球。该络合剂一端与稀土元素连接，一端与生物大分子(例如：抗原或抗体)连接，避免了蛋白质分子之间的交联反应，且由于稀土元素没有和生物大分子直接接触，其不会影响生物大分子的生物活性，也不需要进行解离和增强。但是该方法存在以下缺陷：①由于微球直径较大，常见的在100nm以上，而抗体分子小于10nm，在生物液相反应中限制其相互作用的速度和范围，在快速定量检测中无法进一步提供反应速度；②微球易聚集、沉淀，导致抗体失去活性；③微球与生物大分子链接中采用化学处理，容易使生物大分子失活；④微球制备过程复杂，批次间均一性差，成本高，在微量检测中造成批次间差异大。

发明内容

基于此，本发明利用基因工程方法提供一种桥接蛋白，该分子能够将示踪剂直接与生物大分子连接在一起，即无需使用增强液，或制备微球。

本发明第一方面提供一种桥接蛋白，其用于示踪剂和生物大分子之间的连接。其中生物大分子为能够应用于时间分辨荧光分析法检测的大分子，例如：抗原、抗体、多肽、激素等。

示例性地，所述桥接蛋白包括前导序列A和结合蛋白B，所述前导序列A与结合蛋白B之间直接连接或间接连接。例如，前导序列A与结合蛋白B通过连接肽连接。所述前导序列A与示踪剂偶联连接，所述结合蛋白B与生物大分子连接；

在本发明的一个具体实施方式中，所述桥接蛋白还包括荧光蛋白C，所述荧光蛋白C用于实时监测桥接蛋白的活性。

在本发明提供的一个具体实施方式中，所述前导序列A含有-NH和/或-NH₂。

示例性地，所述前导序列A包括1个或多个赖氨酸，和/或1个或多个精氨酸，和/或1个或多个组氨酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述前导序列A包括赖氨酸，由赖氨酸提供-NH₂或-NH基团。优选地，所述前导序列A包括6个串联的赖氨酸。