[发明专利]鉴别猪圆环病毒2型和3型的二重FQ-PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供一种鉴别猪圆环病毒2型和3型的二重FQ‑PCR检测试剂盒。本发明是针对PCV2和PCV3的Rep蛋白和Cap蛋白基因同源性较低的特点，分别以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为扩增靶区域，各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针(SEQ ID NO:1‑6)，采用实时荧光定量PCR技术，实现对PCV2和PCV3的鉴别检测。本发明提供的检测试剂盒适用于疑似猪圆环病毒感染猪的鼻拭子、口腔分泌物、粪便、血清、肺脏、淋巴结、肾脏等样品中的病毒核酸检测，灵敏度可达1.0×10¹拷贝/μL，同易与其混合感染或感染症状相似的其他病原体之间无交叉反应。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种鉴别猪圆环病毒2型和3型的二重FQ-PCR检测试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2015年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。PCV1一般不引起猪发病， PCV2引起的猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)是目前危害养猪业的一个主要疾病，临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，呼吸道和肠道疾病，繁殖障碍和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)。 2015年6月，一种新型的猪圆环病毒3型(PCV3)在美国首次报道，该病毒也能引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，2016年我国很多省份也检测出PCV3病毒感染，给养猪业造成了严重损失。该病毒基因组全长2.0kb，编码两个主要蛋白：Rep和Cap蛋白，其中PCV3与PCV2的Rep蛋白和Cap 蛋白基因同源性较低。因此建立快速鉴别检测PCV2和PCV3的诊断方法对圆环病毒病的防控和流行病学调查研究具有重要意义。

TaqMan MGB探针具有以下优点：一是MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，增加荧光PCR的特异性；同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，提高了荧光PCR的特异性；二是MGB探针可以区分扩增目的片段DNA中1个碱基的差别，荧光 PCR的特异性大大增强。因此TaqMan MGB探针荧光定量PCR技术比普通荧光定量PCR技术具有更高的灵敏性、特异性。

发明内容

本发明的目的是提供用于猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)二重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测的引物和探针。

本发明的另一目的是提供鉴别猪圆环病毒2型和3型的二重FQ-PCR检测试剂盒。

本发明构思如下：根据PCV2和PCV3Rep蛋白和Cap蛋白基因同源性较低的特点，大量比对 GenBank中PCV2和PCV3Rep蛋白和Cap蛋白基因，在Rep蛋白基因上选取具有PCV2型特异性的部分基因设计特异性引物对和TaqMan MGB探针，在Cap蛋白基因上选取具有PCV3型特异性的部分基因设计特异性引物对和TaqMan MGB探针，可实现在一个反应中同时对PCV2、PCV3进行快速鉴别检测。

为了实现本发明目的，本发明提供用于检测猪圆环病毒2型的FQ-PCR引物和探针，它们的核苷酸序列分别如下(SEQ ID NO:1-3)：

PCV2-P1：5'-TTTGGCCCGCAGTATTCTGA-3'

PCV2-P2：5'-CTGGGACAGCAGTTGAGGAGTA-3'

PCV2-Probe-P5：5'-F1-AGCAATCAGACCCC-Q-3'

其中，F1为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。

用于检测猪圆环病毒3型的FQ-PCR引物和探针，它们的核苷酸序列分别如下(SEQID NO:4-6)：