[发明专利]黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶MdUGT71B1基因及其编码蛋白和应用

说明书

本发明公开一种黄酮醇3‑O‑葡萄糖基转移酶MdUGT71B1基因及其编码蛋白，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，通过PCR扩增获得MdUGT71B1全长序列，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，通过序列比对得到其具有UGT家族的PSPG‑box保守结构域。MdUGT71B1基因的表达量与苹果果皮中黄酮醇糖苷的积累呈正相关关系。在大肠杆菌中进行的体外功能验证表明，MdUGT71B1可以将槲皮素糖基化为槲皮素3‑O‑葡萄糖苷。本发明提供的基因及其编码蛋白在黄酮醇糖苷的生物合成和植物黄酮醇含量的组分改良中的应用。本发明能大量合成黄酮醇3‑O‑葡萄糖苷，为黄酮醇糖苷合成的工程化奠定了基础。

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种参与苹果黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成的基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

黄酮醇是类黄酮化合物的一类，通常以糖苷衍生物形式存在于植物液泡中。黄酮醇苷元多达十余种，其中园艺产品中常见的苷元主要是槲皮素、山柰酚和杨梅素等。近些年，大量研究报道了黄酮醇抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、消炎等医药学活性。黄酮醇广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中，对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线、调节叶片气孔开度等。因此，植物黄酮醇生物合成与代谢调控研究日益增多，逐渐成为热点。

苹果(Malus×domestica)中的黄酮醇主要为槲皮素及其糖苷，包括槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-芸香糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷和槲皮素3-O-鼠李糖苷等。糖基化主要发生在细胞质中，在糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)的催化下，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子上，是一种广泛存在的化合物修饰方式，也是许多次生代谢产物合成反应的最后一步。糖基化可以改变黄酮醇化合物的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。

由于糖苷化产物具有潜在的药用价值以及对植物生命活动调节的重要性，现在已受到人们的广泛关注。因此鉴别出苹果黄酮醇糖苷生物合成相关的糖基转移酶，对于阐明苹果黄酮醇糖苷生物合成途径有重要意义，也可用于其他植物基于基因工程技术的黄酮醇组分改良，对提高食物中的黄酮醇含量，增加食物的保健功能，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种参与苹果黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成的基因MdUGT71B1及其编码蛋白，所述MdUGT71B1基因的CDS序列如SEQ:NO.1所示，编码序列全长为1425个核苷酸，其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，可编码一个含474个氨基酸的蛋白，含有一个保守的PSPG-box结构域，在糖基转移酶大家族中属于GT1家族。

本发明的另一个目的是提供所述MdUGT71B1基因及其编码蛋白在黄酮醇糖苷的生物合成和植物黄酮醇含量的组分改良中的应用。将上述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因连接到pET-32a(+)载体的多克隆位点中构建获得重组质粒，命名为pET-32a(+)-MdUGT75B1。在大肠杆菌中表达pET-32a(+)-MdUGT75B1，得到MdUGT75B1重组蛋白，可将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-半乳糖苷。

本发明提供了一种参与苹果黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成的基因MdUGT71B1及其编码蛋白及其应用。首次克隆并验证了苹果黄酮醇3-O-葡萄糖苷生物合成相关糖基转移酶MdUGT71B1基因的功能。本发明还提供了含有MdUGT71B1基因的重组质粒，为通过生物工程方法大量合成黄酮醇3-O-葡萄糖苷，进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。本发明提供了一种能大量合成黄酮醇3-O-葡萄糖苷的途径，为黄酮醇糖苷合成的工程化奠定基础。

附图说明

图1：光照处理实验中苹果果皮中槲皮素3-O-葡萄糖苷含量检测和MdUGT71B1基因表达分析。