[发明专利]人类黄韧带干细胞的提取方法

权利要求书

1.人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于，有以下步骤：

1)取人类黄韧带组织，冲洗，剪碎；

2)剪碎的组织用一型胶原酶将黄韧带消化；

3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；

4)培养细胞，传代三次；

5)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

2.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤1)所述冲洗，采用无菌PBS反复冲洗人类黄韧带组织直至其无血液。

3.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤2)所述消化在37℃孵箱恒温消化12小时，取上清，用人间充质干细胞完全培养基终止消化。

4.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤3)所述收集的方法是，步骤2)所述的组织消化的上清，离心，吸去上清，用人间充质干细胞完全培养基重悬细胞，形成单细胞悬液。

5.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤4)所述的培养是将单细胞悬液在37℃二氧化碳浓度5％条件下，人间充质干细胞完全培养基培养，至细胞融合达70～80％后，传代三次。

6.根据权利要求5所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于，所述传代的每次传代的方法是：用PBS液清洗两遍细胞，加入人间充质干细胞完全培养基终止消化，离心5分钟，弃上清液，再加入人间充质干细胞完全培养基重悬细胞，将一份细胞分装到3个三分容器中，进行下一次传代。

7.根据权利要求1所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于：步骤5)所述筛选采用浓度为10μg/ml的纤连蛋白(Sigma)溶液筛选。

8.根据权利要求7所述的人类黄韧带干细胞提取方法，其特征在于，所述筛选的方法是：用纤连蛋白PBS溶液覆盖容器底部，4℃放置，12小时后吸去液体，用人间充质干细胞完全培养基清洗容器，吸去培养基，得到融合率已达80％的第三代细胞制得的单细胞悬液，将单细胞悬液放入纤连蛋白铺被的容器中，37℃恒温，30分钟后吸去液体，再加入人间充质干细胞完全培养基，附着在铺被有纤连蛋白的容器底部的细胞即为黄韧带干细胞。