[发明专利]一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法

权利要求书

1.一种牙鲆卵原细胞分离纯化方法，包括：

1）. 将牙鲆雌鱼性腺组织剥去白膜剪碎、离心后得到的沉淀用组合酶液消化，所得细胞消化液经细胞筛网过滤、离心后重悬得到细胞悬液；

其中，所述组合酶液中含有0.20%~0.30%胰蛋白酶以及0.050%~0.060% DNA酶Ⅰ；

2）. 将生理渗透压的Percoll液配制成15%~25%、30%~40%、45%~55%浓度梯度，用制备好的每级Percoll 梯度液按照密度从高到低逐层轻轻沿着管壁流入离心管中制备成Percoll梯度液，将所述细胞悬液置于梯度最上层，每层梯度及所述细胞悬液的量均为1.4ml ~2.5ml；

180G~220G离心20min~40min后，吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞。

2.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述牙鲆雌鱼性腺组织与所述组合酶液的固液比为60mg~140mg：1ml。

3.根据权利要求2所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述消化的条件为：22℃~28℃消化2h~4h。

4.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述组合酶液所用溶剂为含有3%~8% 胎牛血清的培养基。

5.根据权利要求4所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，所述培养基为L-15培养基。

6.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述牙鲆雌鱼为15~20月龄。

7.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，所述离心为：

300G~400G离心力离心5min~10min。

8.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤1）中，还包括：

将所述牙鲆雌鱼性腺组织进行石蜡切片，分别做H-E染色和免疫荧光以鉴定卵原细胞；

所述免疫荧光所染色对象包括：Vasa蛋白。

9.根据权利要求1所述的牙鲆卵原细胞分离纯化方法，其特征在于，在步骤2）后，还包括：

将吸取最上面两层的细胞带得到牙鲆卵原细胞固定后涂片，做免疫荧光以鉴定卵原细胞；

所述免疫荧光所染色对象包括：Vasa蛋白。