[发明专利]通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法

权利要求书

1.一种用于检测含有核酸序列的双链核酸分子中至少一个修饰碱基的方法，所述方法包括步骤：

a)提供由双链茎和单链环组成的核酸发夹分子，其中双链核酸的末端之一直接或间接地附着到表面，并且双链核酸的另一个末端附着到可移动的表面，其中双链核酸未附着至表面的末端与另一末端共价或非共价相连；

b)施加力以使表面之一从另一个表面移开，从而产生变性的发夹分子；

c)使变性的发夹分子与能够特异性结合修饰碱基的蛋白接触；

d)在所述蛋白存在时降低力使发夹分子复性，

其中结合修饰碱基的蛋白引起发夹分子复性的短暂阻断，

e)检测由于发夹分子中蛋白与修饰碱基的结合导致的发夹分子复性的短暂阻断，以及其包括：

1)测量双链核酸分子附着至表面的两末端之间的距离z；

2)当所述双链核酸分子变性时，测量所述双链核酸分子附着至表面的两末端之间的距离z_高；以及

3)比较z和z_高；以及

f)通过确定短暂阻断的位置确定修饰碱基在双链核酸分子中的位置。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中进一步提供与所述序列互补的单链核酸分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述单链核酸的长度包括3至50个核苷酸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的力高于或等于15pN。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的力高于或等于17pN。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的力高于或等于18pN。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)中的力降低到少于或等于12pN。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)中的力降低到少于或等于11pN。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)中的力降低到少于或等于10pN。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中重复步骤a)至f)。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括测量阻断的持续时间。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其包括将阻断的持续时间与不存在蛋白时阻断的持续时间相比较的另一步骤。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括测序所述蛋白结合的核酸序列的步骤。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中可移动的表面是磁珠。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其中力是拉力。

16.根据权利要求15所述的方法，其中力是磁力。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少一个修饰碱基选自表观遗传修饰、错配或SNP。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中修饰碱基选自4-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羰基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶和N⁶-甲基腺苷。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白是抗体或能够结合所述修饰碱基的酶。