[发明专利]一种玻璃化冷冻液及其冷冻方法

说明书

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种玻璃化冷冻液。本发明的玻璃化冷冻液通过添加紫杉醇作为冷冻保护剂，并结合紫杉醇添加方式，获得的玻璃化冷冻液处理可提高卵母细胞解冻后体外受精囊胚发育率。将紫杉醇作为冷冻液中的一添加剂能够起到降低成熟卵母细胞的冷冻损伤和提高受精后胚胎发育能力的作用。并研究紫杉醇添加浓度，获得本发明添加方式的最适浓度。本发明的玻璃化冷冻液可以大幅度提高成熟卵母细胞冷冻解冻后复苏率及囊胚发育率，并对细胞超微结构起到保护作用。

技术领域

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种添加紫杉醇的玻璃化冷冻液。

背景技术

人类的配子和胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度。

由于卵母细胞体积大，含水量多，在冷冻过程中极易形成细胞内冰晶对细胞造成机械性损伤，因此卵母细胞保存的关键在于减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成。冷冻过程中细胞内冰晶形成造成的机械损伤和高浓度的保护液对细胞产生的渗透损伤引起卵母细胞透明带破裂、硬化，皮质颗粒排放，微管、微丝解聚后难以从组装，染色体畸变等，这直接影响到解冻卵母细胞的成活率、体外受精率、早期胚胎成活率和妊娠率，甚至影响到后代的健康。

目前的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，其不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻技术的最佳选择，甚而将此技术运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上。玻璃化冷冻利用高浓度保护剂溶液在受冻时固化，通过粘度的极度增加的特点，从液态变为无结构的玻璃化状态，这种玻璃化状态能保持其溶液状态分子和离子的分离分布。由于玻璃化冷冻技术快速、低成本，避免细胞内冰晶形成等特点，所以成为卵母细胞冷冻的方法。

虽然许多成熟阶段的卵母细胞和未成熟卵母细胞经冷冻处理后均得到了正常后代，但其成功率仍然很低。大多数卵母细胞在玻璃化冷冻过程中都将导致形态及功能上不同程度的损伤。而冷冻造成细胞骨架损伤(微管解聚导致纺锤体紊乱)被认为是冷冻效率降低的重要原因之一。

因此开发一种添加紫杉醇的玻璃化冷冻液，其将对稳定细胞骨架及保护细胞超微结构起到作用，减小玻璃化冷冻过程对细胞的损伤。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种紫杉醇在玻璃化冷冻液中的用途，其对于提高卵母细胞的冷冻后的存活率及受精后胚胎发育率发挥作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

现有玻璃化冷冻技术在冷冻过程中形成的冰晶对卵母细胞骨架是造成伤害的。目前，许多学者认为纺锤体是影响成熟卵母细胞冷冻效果的一个重要因素。成熟卵母细胞纺锤体由α和β两种微管蛋白聚合而成，是微管暂时的动力学结构，对于正常成熟分裂、受精、极体排出和原核迁移都是必不可少的。微管的聚合与解聚在特定生理条件下维持着动态平衡，这种平衡很容易受到各种理化变化(如降温或暴露于冷冻保护剂)的影响。因此微管的形成对环境敏感，并且很容易发生微管解聚，导致纺锤体形成受阻。

紫杉醇作为一种细胞骨架稳定剂，它对微管的结合具有依赖性和可逆性，这一作用降低了聚合所需的微管蛋白的临界浓度，使动态平衡向着微管装配的方向移动，促进微管在体外的重新组装。紫杉醇处理可以大幅度提高成熟卵母细胞冷冻解冻后囊胚发育率，并对细胞超微结构起到保护作用。

本发明提供紫杉醇在玻璃化冷冻液中的用途，对稳定细胞骨架以及提高卵母细胞的囊胚发生率起到作用。

本发明的目的之二在于提供一种添加紫杉醇的玻璃化冷冻液，其对于提高卵母细胞的冷冻后的存活率及受精后胚胎发育率发挥作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

在玻璃化冷冻液中添加紫杉醇。