[发明专利]一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法

权利要求书

1.一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法，其步骤如下：

①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；

②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；

③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；

④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；

⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；

⑥称取细胞色素c，溶解于pH＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/L细胞色素c的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；

⑦称取0.0020～0.0030g Ni纳米材料或Co纳米材料，与150～200μL步骤⑥制得的细胞色素c的溶液混合后，搅拌10～15分钟；

⑧待细胞色素c溶液变色后，用磁铁将Ni纳米粒子或Co纳米粒子吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；通过对比步骤⑥和本步骤得到的吸光度曲线可以看到，曲线的特征峰位发生了红移，从而表明细胞色素c已被Ni纳米材料或Co纳米材料还原。

2.一种基于过渡金属纳米材料还原Cyt c-心磷脂脂质体混合物中的Cyt c的方法，其步骤如下：

①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；

②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；

③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；

④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；

⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；

⑥配置成150～200μmol/L的Fe³⁺Cyt c样品溶液，将0.002～0.003g Ni纳米材料或Co纳米材料加入到150～200μL的Fe³⁺Cyt c样品溶液中，然后利用磁铁将Ni纳米材料或Co纳米材料收集在样品溶液底部，Ni纳米材料或Co纳米材料将Fe³⁺Cyt c还原成Fe²⁺Cyt c；然后再将350～400μL、0.51～1.02mg/L的心磷脂脂质体溶液加入到上述样品溶液中，随后将心磷脂脂质体与Cyt c溶液室温下一起温育20～30分钟，心磷脂脂质体与Fe²⁺Cyt c结合，从而将样品溶液中的Fe²⁺Cyt c氧化成Fe³⁺Cyt c；

⑦摇晃样品溶液让Ni纳米材料或Co纳米材料与混合溶液充分接触，再用磁铁将Ni纳米材料或Co纳米材料吸附在混合溶液底部，从而将样品溶液中的Fe³⁺Cyt c再次还原成Fe²⁺Cyt c。

3.一种基于过渡金属纳米材料检测线粒体中的细胞色素c的方法，其步骤如下：

①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；

②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；

③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；

④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；

⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；

⑥将Hela细胞以pH＝7.4的磷酸缓冲溶液为溶剂配置成浓度为2×10⁵mL^-1的溶液，将放线菌素D以pH＝7.4的磷酸缓冲溶液为溶剂配置成浓度为1μmol/L的溶液，将两种溶液以体积比1：1的比例混合后孵育1h～1.5h，然后分离出线粒体，线粒体中含有Fe³⁺Cyt c，保存在pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，得到线粒体溶液；

⑦向步骤⑥得到的500μL线粒体溶液中加入0.02g～0.03g的Ni纳米材料或Co纳米材料，将线粒体溶液中的Fe³⁺Cyt c转换成Fe²⁺Cyt c，然后对线粒体溶液进行Raman测试，由于Fe²⁺Cyt c拉曼信号比Fe³⁺Cyt c拉曼信号的强度高，从而可以检测出Cyt c的特征信号，并可通过对步骤⑥溶液拉曼信号的相对强度定量检测线粒体释放的Fe³⁺Cyt c。