[发明专利]从发酵液中提取抗菌肽的方法

权利要求书

1.从发酵液中提取抗菌肽的方法，包括：配制种子液、配制发酵培养基、发酵、超滤、分离，其特征在于：所述配制发酵培养基步骤中发酵培养基中添加有包含下列含量物质的发酵增效剂：0～80%尿素、3～5%α-萘乙酸钠、15～18%氧化钙、3～5%硫酸镁、1～5%磷酸二甲酯，总量为100%。

2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述配制发酵培养基步骤为：以100～120份豆粕粉为主料，以12～15份小麦麸皮粉、10～15份玉米粉为辅料，另添加0.8～1.0份蜂蜜、1～1.5份蔗糖，添加蒸馏水至含水量为45～48%，灭菌后加入0.3～0.5份发酵增效剂即得发酵培养基。

3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述配制种子液步骤为：分别培养制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌与米曲霉种子液，分别用无菌生理盐水调节菌数为1.0～1.2×10⁸cfu/mL。

4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述发酵步骤为：取枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌与米曲霉菌的混合种子液，按照发酵培养基干物含量的10.5～12.5%的比例接种入发酵培养基中，恒温静置发酵后振荡水浸提取，后静止沉降，纱布过滤除渣得到发酵豆粕原液。

5.根据权利要求4所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述发酵步骤中，枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母菌种子液与米曲霉菌种子液的质量比为1:0.3～0.5:0.3～0.5。

6.根据权利要求1所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述超滤步骤为：发酵液依次加入活性炭、大孔树脂吸附油脂、杂质颗粒并脱盐，后用滤袋过滤除去吸附剂，再加入过滤机过滤除掉活性炭和多余油脂，得到澄清发酵液；用截留分子量为10KDa、3KDa、1kDa的超滤膜分级过滤发酵液，得到四段不同分子量的多肽混合液组分，浓缩后分别进行真空干燥。

7.根据权利要求1所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述分离步骤为：将四段不同分子量的多肽组分分别用超纯水溶解制成0.12～0.15g/mL浓溶液，先后以凝胶渗透色谱法分离与液相色谱法分离，分别收集各洗脱峰组分，冷冻干燥即得抗菌肽。

8.根据权利要求7所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述分离步骤中，凝胶渗透色谱法分离的色谱条件为：φ7.8mm×300mm，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0～10min 5%B，10～15min 5%B，15～20min 10%B，流速为0.8～1.0mL/min，柱温为28～30℃，波长为220nm。

9.根据权利要求7所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述分离步骤中，液相色谱法分离的色谱条件为：φ4.6mm×250mm，100A；流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0～5min 2.5%B，5～18min 80%B，流速为0.8～1.0mL/min，柱温为28～30℃，波长为220nm。

10.根据权利要求8、9所述的从发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述分离步骤中，凝胶渗透色谱法分离与液相色谱法分离操作中的流动相A与流动相B中均含有550～580ppm的三氟乙酸、35～38ppm的二甲基硅二醇。