[发明专利]一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的多面体探针及其制备方法和应用，包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团；该探针可快速、灵敏、特异检测胞外囊泡内多种核酸分子，可根据临床或研究检测需要对特定的靶标核酸分子进行设计应用。

技术领域

本发明属于医疗检测领域，涉及一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸小分子的多面体探针，可快速、灵敏、特异检测已知序列的多种胞外囊泡核酸小分子；本发明还涉及多面体探针的制备方法和应用。

背景技术

胞外囊泡(EVs)是由肿瘤细胞等多种细胞分泌的、大小为50～1000nm的膜性囊泡小体，常存在于血液、尿液、脑脊液等大多数体液中。EVs可以携带多种胞内物质，如不同来源EVs可包含超过9700种蛋白质、3400种mRNA和2800种microRNA，在细胞间信号传递、肿瘤的发生与预后监测、免疫系统干预等生理病理活动中扮演了十分重要的角色。现有研究表明，受胞体体积的限制，特定来源的外泌体内miRNA浓度远高于其母体细胞内浓度，浓度富集效率甚至可高达166倍，导致少量miRNA可在外泌体内被检出而在循环系统中未能检出。同时，与循环系统中的游离miRNA相比，外泌体内的miRNA由于受囊泡脂质双层膜的保护因而具有更高的酶耐受性，可以在体液中长时间稳定存在，便于到达靶细胞进行稳定的信号转导从而发挥生物学效能。与循环miRNA相比，外泌体内miRNA水平变化更能反映机体内生理病理状态，因此可以作为一种新型的生物标志物，用以评进行疾病的早期诊断、治疗监控和预后评估。

EVs的纳米级结构和miRNA极短的核苷酸序列长度(～22nt)使得EVs内miRNA多重检测极为困难。常规检测组织细胞中miRNA的方法以RT-qPCR为金标准，其灵敏度高，但其cDNA合成、qPCR等步骤耗时耗力且相对昂贵，不适合大规模EVs内miRNA筛查；尽管NorthernBlotting和微阵列检测技术各有其优点，但其灵敏度均欠佳且无法原位检测。原位杂交(FISH)尽管可以实现细胞内miRNA在体检测，然而其较低的灵敏度亦限制了其对于低浓度靶分子的检出。电化学传感器技术结合锁核酸(LNA)技术可有效提升检测特异性，然而其灵敏度和重复性仍有待提高，且上述技术均无法实现EVs的在体直接检测。目前大量的检测方法都集中在miRNA提取后进行检测，而不同提取方法的miRNA提取效率差异极大，即便用数字PCR也无法反映出EVs内miRNA的真实丰度。

若能够实现EVs原位在体检测将能极大克服上述不一致问题，从而真实反映EVs内各种靶分子的丰度。为此，人们进行了如下探索：

Rhee et al曾尝试着利用溶血素O蛋白(Streptolysin O)对EVs胞膜打孔，导入分子信标探针(Molecular Beacon，MB)并进行EVs在体检测，研究发现溶血素O蛋白处理后的探针穿透效率较无处理样本提高了175％。但在胞膜上打孔的方法会潜在破坏EVs外膜，存在EVs内容物外漏的风险，从而导致最终的检测结果偏低。上述方法均缺乏对胞外囊泡完整性的保护，存在EVs内容物外漏的风险，从而可能导致最终的检测结果偏低，仍不能准确检测EVs miRNA。

因此，亟需一种不破坏胞外囊泡完整性的检测方法，能够准确检测EVs内如miRNA等小分子。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的多面体探针；本发明的目的之二在于提供用于检测胞外囊泡miRNA的多面体探针的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述多面体探针在制备检测胞外囊泡内核酸分子的试剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团。