[发明专利]一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：包括与碱性磷酸酶反应的双链DNA底物、Taqman探针、引发Taqman探针的循环切割的双链特异性核酸酶；所述双链DNA底物由5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合得到；

所述磷酸化的T7启动子序列为5’-磷酸-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；

所述模板序列为5’-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG GCC CTA TAG TGA GTC GTATTA-3’；

所述Taqman探针序列为5’-FAM-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG G-Eclipse-3’；所述Taqman探针在5'末端用FAM荧光标记，在其3'末端用Eclipse标记。

2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括双链特异性核酸酶缓冲液，所述缓冲液的组成为：50mmol/L的pH 8.0的Tris-HCl，5mmol/L的氯化镁，1mmol/L的二硫苏糖醇。

3.根据权利要求2所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：Tris-HCl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积比为48-52:3-6:0.6-1.4。

4.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合所用的Tris-EDTA缓冲液和退火缓冲液；所述退火缓冲液为5mmol/L的pH 8.0的Tris-HCl和50mmol/L的氯化钠。

5.根据权利要求4所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：退火缓冲液中Tris-HCl和氯化钠的体积比为0.3-0.7:3-7。

6.一种非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：所述方法使用权利要求1所述试剂盒，具体步骤为：

1)5 '-磷酸化的T7启动子的去磷酸化

将碱性磷酸酶和100nmol/L的双链DNA底物，Cut Smart缓冲液混合，孵育后灭活得到混合溶液A；然后，将1单位的λ核酸外切酶加入到以上混合溶液A中得到混合溶液B，混合溶液B进行先孵育之后，再进行后孵育将λ核酸外切酶灭活，得到混合溶液C；

2)转录反应

取一定体积D的步骤1)中得到的混合溶液C，其中含有一定量的λ核酸外切酶消化产物，在RNA生产系统中反应，得到转录产物溶液E；

3)互补配对

取一定体积F的步骤2)得到的转录产物溶液E、双链特异性核酸酶缓冲液、20个单位的RNA酶抑制剂和600nmol/L的Taqman探针在一定体积的溶液G中反应；

4)荧光检测

荧光光谱用装备有氙灯作为激发光源的荧光分光光度计进行测量，用490纳米的激发波长，在500-650纳米的范围内记录荧光光谱，激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0纳米。

7.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中得到混合溶液A前孵育的温度为30-40℃；孵育的时间为20-40分钟。

8.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中得到混合溶液A前灭活的温度为60-70℃；灭活的时间为3-7分钟。

9.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中混合溶液B先孵育的温度为30-40℃；孵育的时间为20-40分钟。

10.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中混合溶液B后孵育的温度为80-100℃；孵育的时间3-7分钟。