[发明专利]具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法及其产品

说明书

本发明涉及一种具有促进细胞增殖活性的丝胶‑琼脂糖复合凝胶的制备方法及其产品，利用转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝提取中丝胶蛋白的提取含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白，得含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后得复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，再与琼脂糖溶液混合，注模，成型，得具有促进细胞增殖活性的丝胶‑琼脂糖复合凝胶，制得的复合凝胶稳定性好，能够较好的支持NIH3T3细胞的增殖与生长，且细胞毒性低，在组织工程学中具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，还涉及由该方法制得的产品。

背景技术

蚕丝主要由内层的丝素与外层的丝胶组成，含量分别为75％与25％。长期以来，缫丝工业产生的大量丝胶蛋白被视为“废弃物”而排放掉，产生了严重的环境安全隐患。随着研究的深入，研究人员发现丝胶蛋白具有抗氧化、保湿、促进细胞增殖与加速伤口愈合的功效，是潜在生物材料原料。丝胶蛋白在经过化学交联、物理共混、诱导等多种方法交联后能够制备出如丝胶药膏、丝胶-明胶膜、丝胶-羧甲基纤维素基、丝胶聚(乙烯醇)支架等丝胶复合生物材料，体现出巨大的应用价值和潜力。在此基础之上，研究人员也尝试过将功能性蛋白如生长因子等与丝胶蛋白混合后，制备具有功能性的丝胶复合生物材料。例如，Zhang等将神经生长因子(NGF)加入到丝胶-壳聚糖复合支架生物材料中用于缓解和治疗慢性神经嵌压症，并取得一定的疗效；Liu等将葡聚糖与丝胶混合制成药载用于治疗恶性黑色素瘤。然而，受限于传统蚕丝生物材料繁杂的制备流程，功能性单一，以及自身还存在的诸如细胞粘附力弱等缺陷，即使通过后期添加功能性物质可以得到改善，但是功能物质的来源和功效所带来的风险因素，以及生产成本的增加，限制了蚕丝生物材料的市场化，至今也少有获得临床批文以及定型产品。因此，系统探索蚕丝蛋白在仿生材料和生物医学材料等领域中的理论基础与关键技术迫在眉睫。

蚕丝纤维是一种蛋白纤维，主要由丝素和丝胶两类结构性蛋白构成，其中丝素蛋白约占丝纤维的75％，由丝素重链(fib-H chain)、丝素轻链(fib-L chain)和P25三个基因的编码产物按照6：6：1分子比例组成。丝胶蛋白约占丝纤维的25％，主要由丝胶I(Sericin1)，丝胶II(Sericin2)以及丝胶III(Sericin3)基因编码产物组成，其中丝胶I蛋白比重最大。随着家蚕基因组计划的实施，蚕丝合成分泌机制的解析，以及家蚕分子育种技术体系的建立，理论上可以对蚕丝蛋白编码基因进行遗传改良，从根本上改善蚕丝的缺陷，分子培育家蚕改良品系，提升蚕丝纤维的性能和用途，促进蚕丝在生物医疗等高端领域的应用。获得了具有力学性能增强的蚕丝纤维、彩色蚕丝以及特殊功能性蚕丝材料等。在前期的研究中，本课题组通过piggyBac转座酶将人酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)和人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的基因整合至家蚕基因组，利用家蚕丝腺生物反应器表达系统控制FGF1和FGF2特异在家蚕丝腺分泌表达至蚕丝中，遗传改良制备了含重组人源FGF1和FGF2的功能性蚕丝，并具有促进细胞增殖的功能。

琼脂糖是一种由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链线性的多聚物，其在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，并且，还可以通过调节琼脂糖的浓度制备不同力学强度的凝胶材料。因此，部分研究者尝试了将琼脂糖用于制备各种凝胶生物材料。例如Singh等人利用琼脂糖与丝素蛋白制备了一种丝素蛋白-琼脂糖复合凝胶，该凝胶材料能够有效地维持猪耳廓软骨细胞的细胞活力与增殖生长，提高细胞外基质的沉积；Bhat等人利用壳聚糖、琼脂糖与明胶制备了复合冷冻胶凝，该凝胶材料能够支持成纤维细胞、心脏细胞、C2C12细胞以及Cos 7细胞的增殖与生长，表明其能够帮助皮肤、软骨以及骨骼等损伤组织的恢复。

为深度开发利用人源FGF1/FGF2功能性蚕丝，有必要制备具有生物活性的FGF1/FGF2再生丝胶蛋白生物材料。

发明内容