[发明专利]程序性死亡受体1抗体磁珠的制备方法及其应用

权利要求书

1.程序性死亡受体1（PD-1）抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述制备方法为：将14株抗人PD-1单克隆抗体分别与羧基磁珠偶联，制备PD-1抗体磁珠；

所述14株抗人PD-1单克隆抗体源于加拿大YES公司生物技术研究有限公司，14株抗人PD-1单克隆抗体的克隆号分别为：7E5，1H8，1C4，9A5，9B4，7C9，3E5，7G12，9E11，5B2，5H7，2H7，B1C4，2C4。

2.根据权利要求1所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述羧基磁珠是由苏州海狸生物工程有限公司研发，羧基磁珠直径2um。

3.根据权利要求1所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：

（1）混匀Mag磁珠后，取100 μL Mag磁珠到1 mL离心管中，磁性分离去除上清液，用200μL MEST溶液进行磁性分离洗涤2次，然后移除上清液；所述MEST溶液中含有浓度为100 mM2-(N-吗啡啉）乙磺酸，MEST溶液的pH 5.0，MEST溶液中含有体积分数为0.05%吐温20；

（2）迅速加入配制的 100 μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和100μLN-羟基琥珀酰亚胺溶液到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30min，活化期间保持磁珠的悬浮状态；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液溶液的浓度为10~50 mg/mL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液溶液以MEST/乙醇/超纯水作分散剂；所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为10~50 mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺溶液以MEST/乙醇/超纯水溶液作分散剂。

4.根据权利要求1所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述羧基磁珠与抗人PD-1单克隆抗体的共价偶联，具体包括以下步骤：

（1）磁性分离活化的羧基磁珠去除上清液，加入50 μg~200 μg生物配体轻柔地混匀；所述生物配体为14株抗人PD-1单克隆抗体中的一种；

（2）25℃偶联2 h，或25℃偶联1 h后放置4℃静置过夜，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；

（3）去除上清液，加入400 μL PBST溶液重悬磁珠，25℃反应1 h封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；所述PBST溶液的pH 7.2，且PBST溶液含1%（w/v）BSA；

（4）去除上清液，每次用400 μL PBS溶液或添加有1%(w/v)BSA的PBS的保存溶液洗涤3次后，重新悬浮于添加有1%(w/v)BSA的PBS的保存溶液中，保存于4℃，得到PD-1抗体磁珠；所述PBS溶液的pH 7.2。

5.根据权利要求4所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述羧基磁珠与抗人PD-1单克隆抗体的共价偶联的步骤（1）中的生物配体用量为400ug-600ug，生物配体浓度5-10mg/ml，保持溶液pH≈8.0，所述羧基磁珠与抗人PD-1单克隆抗体的共价偶联的步骤（1）加入体积分数0.05%吐温20以提高磁珠分散性。

6.根据权利要求4所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述磁珠与抗体的共价偶联的步骤（3）或步骤（4）中去除上清液是通过将离心管置于磁性分离架上磁性分离实现的。

7.根据权利要求4所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述步骤（4）所述添加有1%BSA的PBS的保存溶液的用量为100-400ul。

8.根据权利要求4所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述磁珠表面抗体的偶联量：1ml磁珠结合1mg抗体。

9.根据权利要求3或4所述的PD-1抗体磁珠的制备方法，其特征是，所述活化期间保持磁珠的悬浮状态是用垂直混合仪进行颠倒混匀实现的；偶联期间保持磁珠的悬浮状态是利用垂直混合仪进行颠倒混匀实现的。

10.权利要求1-9所述制备方法得到的PD-1抗体磁珠的应用，其特征是，将单个克隆的抗体磁珠、两个克隆的抗体磁珠或者多个克隆的抗体磁珠应用于CIK、CART、TIL淋巴细胞免疫治疗领域，用于剔除PD-1阳性细胞。