[发明专利]一种土壤纤维素酶的测定方法

权利要求书

1.一种土壤纤维素酶的测定方法，其特征在于土壤纤维素酶的测定方法按以下步骤进行：

一、将采自田间的农田土风干，称取过筛的风干土样10.01～10.04g于50ml三角瓶中，用移液管准确加入甲苯1.5±1μl，放置14min～16min，然后加入pH6.0的改进缓冲液5ml±0.5ml，再加入羧甲基纤维素溶液5ml±1ml，再用保鲜膜将容器口封好，放置于37℃～38℃的环境中培养72～73h；

二、制备无基质对照：称取过筛的风干土样10.01～10.04g于50ml三角瓶中，用移液管加入甲苯1.5±1μl，然后加入pH6.0的改进缓冲液5ml±0.5ml，放置14min～16min，然后加入蒸馏水5ml±1ml，再用保鲜膜将容器口封好，放置于37℃～38℃的环境中培养72～73h；无土壤对照：用移液管加入甲苯1.5±1μl，放置14min～16min；然后加入pH6.0的改进缓冲液5ml±0.5ml，再加入羧甲基纤维素溶液5ml±1ml，再用保鲜膜将容器口封好，放置于37℃～38℃的环境中培养72～73h；

三、将经过培养的土样转移到离心管中，在转速3500～4000r/min下离心5min，再过滤上清液，取1mL～2mL滤液于50mL容量瓶中，加2.9mL～3.1mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，然后加水10mL～15mL，在沸水浴中加热5min，取出立即冷水浴中冷却至室温、定容，以空白管调零在波长540nm处测定吸光度值；

四、根据葡萄糖标准液的标准曲线计算出待测土样、无基质对照和无土壤对照的葡萄糖毫克数，再计算出待测土壤中纤维素酶的活性；

纤维素酶活性以每克烘干土样在72h内生成葡萄糖毫克数表示：

纤维素酶活性＝(A－b－c)×n/m

A为待测土样中葡萄糖毫克数、b为无土壤对照中葡萄糖毫克数、c为无基质对照中葡萄糖毫克数，n为分取倍数，m为烘干土重；

所述改进缓冲液每升由12.10～12.14g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60～11.64g顺丁烯二酸、14.00～14.10g柠檬酸一水化合物、6.30～6.34g硼酸、500～510mL浓度为1mol/L的NaOH溶液和余量的蒸馏水制成，并调节pH值至6.0；

步骤三中3,5-二硝基水杨酸溶液是在120～125ml水中加入1.25g二硝基水杨酸和50ml、浓度为1.95mol/L～2.05mol/L的NaOH溶液，二硝基水杨酸溶解后再加75g酒石酸钾钠并用水稀释至250ml。

2.根据权利要求1所述的土壤纤维素酶的测定方法，其特征在于步骤一中筛子的孔径为2mm。

3.根据权利要求1所述的土壤纤维素酶的测定方法，其特征在于步骤一中羧甲基纤维素溶液的浓度为1％。