[发明专利]分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法

权利要求书

1.分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1）宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5-氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；

2）纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建:

将SEQ ID NO.1所示的DNA片断H1经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H1，再将SEQ ID NO.2所示的DNA片断H2经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H1的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU1；

将SEQ ID NO.3所示的DNA片断H3经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H3，再将SEQ ID NO.4所示的DNA片断H4经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H3的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU2；

将SEQ ID NO.5所示的DNA片断H5经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H5，再将SEQ ID NO.6所示的DNA片断H6经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H5的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU3；

将SEQ ID NO.7所示的DNA片断H7经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H7，再将SEQ ID NO.8所示的DNA片断H8经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H7的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU4；

将SEQ ID NO.9所示的DNA片断H9经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H9，再将SEQ ID NO.10所示的DNA片断H10经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H9的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU5；

将SEQ ID NO.11所示的DNA片断H11经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H11，再将SEQ ID NO.12所示的DNA片断H12经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H11的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU6；

将SEQ ID NO.13所示的DNA片断H13经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H13，再将SEQ ID NO.14所示的DNA片断H14经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H13的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU7；

将SEQ ID NO.15所示的DNA片断H15经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H15，再将SEQ ID NO.16所示的DNA片断H16经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H15的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU8；

将SEQ ID NO.17所示的DNA片断H17经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H17，再将SEQ ID NO.18所示的DNA片断H18经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H17的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU9；

将SEQ ID NO.19所示的DNA片断H19经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H19，再将SEQ ID NO.20所示的DNA片断H20经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H19的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU10；

将pUC18-HRU1、pUC18-HRU2、pUC18-HRU3、pUC18-HRU4、pUC18-HRU5、pUC18-HRU6、pUC18-HRU7、pUC18-HRU8、pUC18-HRU9和pUC18-HRU10分别用BamHI消化后，进行末端平滑化处理，分别得到载体片段V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9和V10；

将质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-ABGL1-TadhI经XhoI和ScaI双酶切，得到的3.6kbDNA片断进行末端平滑化处理后与V1进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP1；

将质粒YEplac195-Ptpi-xyn2s-TEGII-TadhI经HindIII和EcoRI双酶切，得到的2.3kbDNA片断进行末端平滑化处理后分别与V2和V5进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP2和IP5；

将质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-AEGI-TadhI经PstI酶切，得到的1.8kb DNA片断进行末端平滑化处理后与V3进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP3；

将质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-TCBHI-TadhI经StuI和ScaI双酶切，得到的2.6kbDNA片断进行末端平滑化处理后分别与V4、V7和V10进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP4、IP7和IP10；

将质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-ACBHI-TadhI经MluI和ScaI双酶切，得到的2.8kbDNA片断进行末端平滑化处理后分别与V6和V8进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP6和IP8；

将质粒pGEM-T easy-Ptpi-xyn2s-TCBHII-TadhI经StuI和ScaI双酶切，得到的2.6kbDNA片断进行末端平滑化处理后与V9进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP9；

所述pUC18-RYUR 的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

3）酵母转化与筛选：

将所述质粒IP1经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα1；

将所述质粒IP2经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα1，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα2；

将所述质粒IP3经PvuII酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα2，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα3；

将所述质粒IP5经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα3，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα4；

将所述质粒IP4经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα4，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα5；

将所述质粒IP7经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα5，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα6；

将所述质粒IP10经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα6，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα7；

将所述质粒IP9经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα7，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα8；

将所述质粒IP6经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα8，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα9；

将所述质粒IP8经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα9，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5-氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα10。