[发明专利]一种牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白、基因及其应用

说明书

本发明公开了一种牛乳铁蛋白肽‑人溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是由猪肌原纤维蛋白抗氧化肽、牛乳铁蛋白肽、鸡卵清蛋白抗氧化肽、猪肌原肌球蛋白抗氧化肽、柔性连接肽、人溶菌酶依次串联构成。通过融合表达动物来源的阴离子抗氧化肽，抵消抗菌肽的正电荷，减轻抗菌肽对宿主菌的抑制；抗氧化肽有利于增加抗菌肽的储存稳定性，该融合蛋白4℃放置20d内对大肠杆菌(ATCC 25922)抑菌抗菌活力仅下降7.7％。30d后其对大肠杆菌(ATCC 25922)的活力仅损失15.4％。

(一)技术领域

本发明涉及一种牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶、基因及其应用。

(二)背景技术

医疗和动物养殖领域抗生素的滥用造成耐药细菌的流行，对人类健康造成严重威胁。迫切需要研发用以替代抗生素的新型抗菌药物或饲料添加剂。抗菌肽和溶菌酶是一类具有杀菌活性的天然多肽和蛋白，其做为抗生素替代品已广泛应用于临床医药和食品工业。

抗菌肽的抗菌机理为带正电荷的抗菌肽与带有负电荷的细菌细胞膜结合，通过造成膜穿孔或抑制细菌的生理代谢过程造成细菌死亡。牛乳铁蛋白N末端含有两个由蛋白酶消化产生的抗菌结构域lactoferricin(LFC)17–30和lactoferrampin(LFA)265–284。溶菌酶通过分解细胞壁上肽聚糖的β-(1,4)糖苷键发挥其杀菌作用。乳铁蛋白抗菌肽和溶菌酶具有良好的热稳定性，特别是在酸性条件下，加热甚至高温高压处理对其抗菌活性没有影响，是很好的传统抗生素替代品。

中国发明专利CN101649311B公开了一种人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的制备方法，它采用基因工程的方法构建人溶菌酶-抗菌肽重组质粒，然后在真核表达人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白。然而由于溶菌酶和抗菌肽通常带有阳离子正电荷，与带有阴离子的DNA可能发生相互作用，对基因工程宿主菌具有一定的细胞毒性，通常采用融合蛋白的形式进行表达，以减弱该细胞毒性。中国发明专利CN105061603A公开了一种抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白的杂合蛋白的制备方法，它将杂合蛋白在大肠杆菌中与Sumo标签进行融合表达，之后纯化融合蛋白，切除Sumo标签，得到目的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白。李青和周晓宏(食品科学2013)人工合成编码多聚阳离子抗菌肽与多聚阴离子肽融合蛋白的DNA序列，并在酵母菌中表达。然而这两种方法所用的融合蛋白本身对最终的产品功能没有帮助，得到的产品需要后处理，纯化成本太高。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种乳铁蛋白肽-人溶菌酶杂合蛋白及应用，产物无需裂解，即具备比乳铁蛋白肽和人溶菌酶更强的抗菌活性和储存稳定性。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白，所述融合蛋白是由猪肌原纤维蛋白抗氧化肽(SEQ ID NO.1)、牛乳铁蛋白肽(SEQ ID NO.4)、鸡卵清蛋白抗氧化肽(SEQ IDNO.2)、猪肌原肌球蛋白抗氧化肽(SEQ ID NO.3)、柔性连接肽(SEQ ID NO.7)、人溶菌酶(SEQ ID NO.5)依次串联构成，其中猪肌原纤维蛋白抗氧化肽(SEQ ID NO.1)、牛乳铁蛋白肽(SEQ ID NO.4)之间连有DPNG连接序列，牛乳铁蛋白肽(SEQ ID NO.4)、鸡卵清蛋白抗氧化肽(SEQ ID NO.2)之间连有NGDPE序列，柔性连接肽(SEQ ID NO.7)与人溶菌酶(SEQ IDNO.5)之间连有EDPNG序列(图1中a)。上述序列之间的NGDPE和EDPNG均是易于被酸、羟胺和胃蛋白酶水解的氨基酸位点。

进一步，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供一种所述牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。

此外，本发明还涉及一种所述牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白在制备抗菌饲料添加剂中的应用。

进一步，所述抗菌饲料添加剂为畜禽饲料添加剂，更优选为所述抗菌饲料添加剂为仔猪饲料添加剂。