[发明专利]一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器及其构建方法

说明书

本发明公开了一种用于电化学检测磷酸化β‑淀粉样蛋白的生物传感器及其构建方法。将金电极与巯基羧酸类化合物反应，在金电极表面修饰羧基；采用EDC/NHS混合溶液将金电极表面修饰的羧基活化，再将活化羧基与Aβ抗体进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后，采用乙醇胺封闭金电极表面的未反应位点，即在金电极表面修饰Aβ抗体；将表面修饰Aβ抗体的金电极先与磷酸化β‑淀粉样蛋白进行抗体抗原反应，再与Ti⁴⁺‑TiP‑Cd²⁺信号探针纳米粒子进行螯合反应，即得直接用于电化学检测的生物传感器，该生物传感器能实现磷酸化β‑淀粉样蛋白定量检测，且检测方法简单，灵敏度高，有利于推广使用。

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种高灵敏度电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白生物传感器，及其构建方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

阿尔茨海默症已经成为二十一世纪威胁人类健康的重大疾病之一，它是一种神经系统退行性疾病，特点为认知能力逐步下降，不可逆的有害的障碍以及可观察到的记忆障碍。淀粉样β-蛋白(Aβ)是存在于阿尔茨海默病(AD)患者脑中淀粉状蛋白斑块的主要蛋白组分，淀粉状蛋白斑块的形成与淀粉样β-蛋白的逐步积累有关。而淀粉样β-蛋白聚集物中存在特别丰富的磷酸化修饰，有研究表明，细胞外的Aβ在蛋白激酶的分泌变体磷酸化。Aβ丝氨酸(Ser)8残基的磷酸化促进其聚集成寡聚体和纤维状组装体。Ser8的磷酸化也减弱了某些蛋白酶对Aβ的蛋白水解降解以及小胶质细胞的清除。研究显示，通过使用pSer8Aβ特异性单克隆抗体，早期神经元聚集在转基因小鼠和人脑中pSer8Aβ的聚集增加。这些发现突出了Aβ磷酸化在AD发病机制中的合理作用。

Aβ也可以在Ser26上进行磷酸化，从而调节其在体外的聚集。研究Ser26磷酸化对人类AD大脑和转基因小鼠模型的聚集，毒性及其存在的影响。证明了人类和转基因小鼠大脑中Ser26磷酸化Aβ的特殊沉积，其与针对其他Aβ物种所观察到的不同。值得注意的是，Ser26上Aβ的磷酸化强烈促进了低分子量可溶性Aβ寡聚体的形成和稳定化，并且对人神经元具有增加的毒性。

目前，国内外对于Aβ磷酸化的研究主要在于其在AD发病机制中的合理作用，也就是主要致力于机理研究，而对于Aβ磷酸化的定量研究尚未成为研究热点。因此发明一种能快速检测P-Aβ的含量，且灵敏性高，易于操作，并能特异性识别P-Aβ的方法就显得尤为重要。但由于实际样本中磷酸根大背景的干扰，如果检测方法不能准确的识别P-Aβ，会使其灵敏性降低，而且使用磷酸化抗体会大大增加检测成本。所以设计一个高灵敏度，高特异性检测P-Aβ分子的方法具有显著的应用前景。

发明内容

针对现有技术中对P-Aβ的检测手段存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种抗干扰能力强、检测限低、具有特异性识别、检测灵敏度高的用于电化学方法检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器。

本发明的另一个目的是在于提供一种操作简单、低成本的构建所述生物传感器的方法。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其包括以下步骤：

1)将金电极与巯基羧酸类化合物反应，在金电极表面修饰羧基；

2)采用EDC/NHS混合溶液将金电极表面修饰的羧基活化，再将活化羧基与Aβ抗体进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后，采用乙醇胺封闭金电极表面的未反应位点，即在金电极表面修饰Aβ抗体；

3)将表面修饰Aβ抗体的金电极先与磷酸化β-淀粉样蛋白进行抗体抗原反应，再与Ti⁴⁺-TiP-Cd²⁺信号探针纳米粒子进行螯合反应，即得。

优选的方案，金电极浸泡在含巯基羧酸类化合物的溶液中反应12～14h，使巯基羧酸类化合物的巯基与金电极表面反应。