[发明专利]一种基于19F-NMR技术快速检测利奥西呱与蛋白相互作用的方法

权利要求书

1.一种基于¹⁹F-NMR技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，包括步骤：

1)将氘代DMSO重水按体积比1：2混合，以该溶剂溶解利奥西呱；配制利奥西呱-人血清蛋白摩尔浓度比为1:0,1:0.02,1:0.11,1:0.44,1:0.66,1:1,1:1.33,1:2,1:3的混合溶液，以三氟乙酸定标，检测混合体系¹⁹F-NMR谱，调节NMR参数；记录化学位移，利用以下公式计算结合常数和结合位点数：

其中δ_t是实测化学位移，δ_c是游离配体化合物化学位移，δ_b是结合态化合物位移，K为结合常数，F是化合物浓度，B是蛋白浓度，n为结合位点数量；

2)利用华法林和布洛芬为位点竞争试剂判断利奥西呱结合位点，配制摩尔浓度比为1:1的利奥西呱-人血清蛋白溶液，以三氟乙酸定标，在该复合溶液中加入华法林溶液作为位点1竞争试剂，该复合溶液中加入布洛芬溶液作为位点2竞争试剂，检测其结合位点。

2.如权利要求1所述的基于¹⁹F-NMR技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤1)所述的调节NMR参数为：脉冲程序调至zgf1qn，扫场次数调至8219，采样点数调至131072，空扫次数调至4，谱宽调至89285.711Hz，采样时间调至0.7340032sec，增益调至210.38，弛豫时间调至1.00000000sec，脉宽调至17.9usec。

3.如权利要求1所述的基于¹⁹F-NMR技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤1)所述的DMSO在整个体系中的体积含量控制在5％以下。

4.如权利要求1所述的基于¹⁹F-NMR技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤1)优化了数据处理方式，所述公式中仅δ_t，F和B三个已知变量，其余δ_c，δ_b和n为未知参数，利用matlab数据处理软件拟合出浓度与化学位移相关曲线，调节运算初始值，及其上下限范围，即设置初始估值分别为：K，5000，上下限为1000000和100；δ_b为-42，上下限为100和-100；n初始值为1，上下限为10和0。

5.如权利要求1所述的基于¹⁹F-NMR技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)配制0.01M pH 7.4PBS溶液，以该溶液溶解浓度依次为6，4，2.67，2，1.32，0.66，0.22，0.04mM的人血清白蛋白各600μL；

2)将氘代DMSO重水按体积比1：2混合，以该溶剂溶解利奥西呱，使利奥西呱终浓度为80mM；

3)将80mM浓度利奥西呱精密取40μL加入不同浓度血清蛋白溶液中，使利奥西呱终浓度为2mM，另外在PBS中加入相同体积上述溶液配制为只有利奥西呱的对照溶液，配制成配体蛋白摩尔浓度比为1:0,1:0.02,1:0.11,1:0.44,1:0.66,1:1,1:1.33,1:2,1:3混合溶液；

4)将步骤3)制备的蛋白利奥西呱混合溶液涡旋混匀，于室温下孵育60min，转移至核磁管中，送入核磁谱仪检测，调整NMR参数：脉冲程序调至zgf1qn，扫场次数调至8219，采样点数调至131072，空扫次数调至4，谱宽调至89285.711Hz，采样时间调至0.7340032sec，增益调至210.38，弛豫时间调至1.00000000sec，脉宽调至17.9usec；

5)图谱检测完成后，进行傅里叶变换，调整相位，对图谱定标，将-75.58ppm左右的三氟乙酸定位为0ppm，得出未加蛋白时利奥西呱化学位移为-43.03ppm，加入蛋白的利奥西呱向低场位移，说明氟原子与蛋白发生相互作用；

6)根据利奥西呱化学位移和一下公式计算结合常数和结合位点数：

其中δ_t是实测化学位移，δ_c是游离配体化合物化学位移，δ_b是结合态化合物位移，K为结合常数，F是化合物浓度，B是蛋白浓度，n为结合位点数量；根据以上公式用matlab拟合曲线，利用fitting tool中的custom equation自定义公式，设置初始估值分别为：K，5000，上下限为1000000和100；δ_b为-42，上下限为100和-100；n初始值为1，上下限为10和0；

7)在摩尔浓度比为1：1的利奥西呱-人血清白蛋白混合溶液中加入不同浓度华法林和布洛芬，送入核磁谱仪检测，进行傅里叶变换，调整相位，以三氟乙酸定标，得到人血清白蛋白使利奥西呱的信号消失，华法林的加入使利奥西呱信号重新出现，故利奥西呱与华法林结合物位点一致。