[发明专利]中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建和应用

权利要求书

1.一种中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建方法，包括以下步骤：

1)引物设计：基于CWMV侵染性cDNA克隆的RNA2的突变体质粒pCB-35S-M5设计引物P1F/P1R，其中P1F的引物包含有SpeI、KpnI、MluI三个酶切位点，P1R的引物包含有SaII的酶切位点；

2)扩增反应：以pCB-35S-M5的质粒为模板，采用高保真的Phusin DNA聚合酶进行扩增，其中引物对P1F/P1R扩增的PCR产物长约为550bp；

3)pCB-35S-MCS突变体的构建：扩增的PCR产物进行切胶纯化回收后用SpeI/SaII进行双酶切，酶切产物经纯化后，连接至同样双酶切处理的pCB-35S-M5上，转化大肠杆菌，测序验证获得重组质粒pCB-35S-MCS。

2.一种中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的应用，包括以下步骤：

1)农杆菌的转化：取重组质粒pCB-35S-MCS 3-5μL用电击转化的方法将其转化至农杆菌GV3101中，于28℃的生化培养箱中培养3天；

2)农杆菌的浸润侵染：挑取pCB-35S-MCS阳性克隆和于实验室-80℃保存的pCB-35S-R1菌液分别接种到含Kan⁺抗生素的YEP液体培养基中，于28℃、220rpm/min的水平摇床中振荡培养过夜，次日按1:100将菌液转接到新的5mL含Kan⁺抗生素的YEP液体培养基中，28℃、220rpm/min的水平摇床中振荡培养至OD₆₀₀值在0.6-1.5之间并收集农杆菌菌液；用烟草浸润液重悬菌液并于室温下放置2-3小时后，将两者按照1：1的比例混匀，并用注射的方法接种本氏烟叶片；

3)侵染活性分析：二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化；

4)沉默效果分析：三周后进行靶基因表达量的分析并记录植株表型变化。