[发明专利]一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法

说明书

本发明公开了一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法。本发明的技术方案要点为：试纸条的底层为PVC板构成的支撑层，该支撑层上依次黏附有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的多肽P25表位抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有新城疫病毒mAb溶液印制的检测线和兔抗鸡IgG溶液印制的质控线，多肽P25的氨基酸序列为TCPDEQDYQLRMA(Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Leu Arg Met Ala)。本发明还具体公开了该鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法。本发明的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条检测快速且特异性强，便于在现场快速检测NDV病毒。

技术领域

本发明属于免疫层析试纸条的制备技术领域，具体涉及一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle Disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高触性禽类传染病，其发病率与死亡率都很高，严重危害着我国养禽业的发展。新城疫病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属，单股负链RNA病毒，有囊膜，其基因组全长为15186bp，编码6个结构蛋白，包括磷蛋白(P)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)以及血凝素-神经氨酸蛋白(HN)六种蛋白。血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)具有血凝素活性(HA)及神经酸氨酶活性(NA)并能协同F蛋白发挥作用，在病毒感染过程中，HN蛋白特异性地识别宿主细胞表面唾液酸受体，这是病毒感染宿主细胞所必须的，并且能够诱导机体产生保护性免疫抗体。

目前，常用的检测方法有血凝素反应(hemagglutinin，HA)、血凝抑制反应(hemagglutinin inhibition，HI)、酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)和实时定量PCR等检测方法，然而这些方法都比较耗时费力，需要实验室特殊的设备才能检测，并且不能及时地对鸡新城疫病毒的流行传播做出诊断。现有的NDV免疫胶体金检测方法是通过小鼠骨髓瘤细胞制备NDV单克隆抗体，然后标记胶体金制备NDV快速检测试纸条，此方法需要制备纯化的抗原、免疫小鼠及饲养动物细胞等繁琐的过程。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法，根据鸡新城疫病毒HN蛋白设计合成13条多肽，分别与鸡新城疫病毒临床抗体进行ELISA检测，筛选到多肽P25(其氨基酸序列为TCPDEQDYQLRMA)能够与鸡新城疫病毒发生特异性反应，将多肽P25吸附于亲和层析柱，从鸡新城疫高免血清中筛选针对多肽P25的表位抗体，再将多肽P25表位抗体标记胶体金后制备快速检测试纸条用于快速检测鸡新城疫病毒。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述试纸条的底层为PVC板构成的支撑层，该支撑层上依次黏附有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的多肽P25表位抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有新城疫病毒mAb溶液印制的检测线和兔抗鸡IgG溶液印制的质控线，检测线和质控线之间的距离为5mm，多肽P25的氨基酸序列为TCPDEQDYQLRMA。

进一步优选，所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2mm，金标抗体结合垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm，吸收垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm。

本发明所述的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，其特征在于具体步骤为：

(1)鸡新城疫病毒高免血清的制备