[发明专利]一种HBV中HBx蛋白核心区段的可溶化和纯化及单克隆抗体

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种HBV中HBx蛋白核心区段HBxΔNΔC的纯化方法和HBxΔNΔC单克隆抗体。本发明通过改变原有纯化方法中各种缓冲液的配方和纯化工艺，得到有活性的、稳定的、均一的、高纯度的、单体的HBxΔNΔC样品，便于进行标准化、大规模的生产和制备；利用得到的HBxΔNΔC进一步制备得到鼠源HBxΔNΔC单克隆抗体和可稳定表达鼠源HBxΔNΔC单抗的杂交瘤细胞株。本发明方法得到的HBxΔNΔC以及HBxΔNΔC单抗可作为科学研究试剂，鼠源HBxΔNΔC单抗还可作为乙型肝炎病毒HBV感染疾病的检测试剂，将鼠源HBxΔNΔC单抗进行人源化可得到人源化的HBxΔNΔC单抗，可作为科学研究试剂、HBV感染疾病的检测试剂和辅助治疗制剂。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒（HBV）中HBx蛋白核心区段HBxΔNΔC的可溶化和纯化方法，以及HBxΔNΔC单克隆抗体。

背景技术

包涵体蛋白变复性方法，是一个传统的将包涵体蛋白进行可溶化的方法。该方法首先使用高浓度的变性剂将包涵体蛋白溶解，例如使用含8 M尿素或6 M硫脲的缓冲液将包涵体蛋白溶解。之后，通过将高浓度的变性剂除去的过程，使得包涵体蛋白从变性状态复性成可溶的状态，例如使用不含变性剂的缓冲液透析等方法去除变性剂，使得包涵体蛋白复性可溶。由于对蛋白质折叠复性过程和规律还缺乏了解，担心复性得到的可溶蛋白样品与天然的、可溶化表达的蛋白样品之间可能存在的结构与功能之间的差异，使得对如何改进包涵体蛋白复性过程以帮助包涵体蛋白正确的折叠还缺乏研究和报导，这一方面使得包涵体变复性方法一直未有深入的研究和发展，限制了该方法的广泛应用；另一方面，因为还没有将包涵体蛋白正确折叠复性的方法，也使得包涵体成为蛋白研究中的难点。

乙型肝炎病毒（HBV病毒）中的HBx蛋白，是病毒在人体内复制所必须的蛋白，它在病毒感染引起肝炎和肝癌的病变中起着关键的作用，是HBV感染引起相关疾病的一个重要靶标蛋白。由于HBx蛋白在大肠杆菌等表达系统中基本上都是以包涵体形式存在，目前还未能成功找到将它可溶化为有活性、稳定和高均一性蛋白的方法。使用高可溶性的融合蛋白如Nus，Trx，GST，MBP等可以帮助HBx蛋白的可溶表达，并已开展了很多相关的HBx功能的研究工作。但是，这些融合蛋白结合HBx表达得到的蛋白样品有如下缺点：浓度通常只能达到1mg/ml左右，酶切掉融合蛋白后HBx马上会沉淀，较大的融合蛋白可能会影响到HBx与其它蛋白、核酸的相互作用。获得可溶性的、有活性的、稳定的、均一的该靶标蛋白以及专一性结合HBx的单克隆抗体，一直是个未能攻克的难关，严重限制了HBV感染引起疾病过程中HBx的具体功能机制研究和以该蛋白为靶点的相关药物研发。

HBV病毒中的HBx序列高度保守，HBx蛋白全长包含154个氨基酸，其中有8-9个半胱氨酸，已有文献提示这些半胱氨酸形成多个分子内或分子间的二硫键，这很可能是该蛋白通常以包涵体形式存在、难以可溶化的主要原因。HBx蛋白的核心区段，即包含了HBx全长蛋白的第12到第127个氨基酸，这个核心区段广泛地存在于亚洲HBV感染引起的肝癌患者中，发明人将其命名为HBxΔNΔC。它是从公开的HBx序列（UniProtKB/TrEMBL 序列号Q8V1I7）中截掉N端11个氨基酸和C端27个氨基酸获得，其理论分子量为12450.25 Da，理论等电点为7.93，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO1所示：

ARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLSSPSSSTVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLAAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEI

公开的文献中报导了一种可溶化和纯化HBxΔNΔC的方法，使用该方法得到的HBxΔNΔC在溶液中具有高度可溶性，但得到的HBxΔNΔC样品不稳定、易降解、状态不均一、纯度不够高、功能不稳定（图1），无法大规模生产和制备出有活性的、稳定的、高均一性的、高纯度的蛋白制剂，只适合实验室小范围的研究，不具有商业应用前景。

发明内容