[发明专利]一种利用关键酶抑制剂来创制小麦生理型突变体的方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用关键酶抑制剂来创制小麦生理型突变体的方法，该方法采用甲羟戊酸代谢途径中的HMGR和FPPS两个关键酶，在小麦生长发育过程中，通过分别添加相应关键酶的抑制剂，抑制植物体内已经表达的关键酶活性，阻止其参与的催化反应，模拟关键酶基因的功能缺失；采用这种处理等同于创制植物关键酶基因的突变体，使其产生无催化活性的酶蛋白分子，进而对植物的表型产生影响，从而达到验证植物体内关键酶基因功能的目的，这种方法操作简便，创制的生理型突变体表型明显，易观察、易测定；不需要复杂的转基因技术；避开了利用RNAi技术敲除小麦基因组中存在的功能基因，使其功能完全失活或对功能基因敲除不够彻底的技术屏障。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用关键酶抑制剂创制小麦生理型突变体的方法。

背景技术

生物突变体是指发生突变的生物个体，具有与野生型不同的表型。突变体是遗传学研究所必需的基础材料，在基因功能研究、作物遗传育种和品质改良等方面具有重要作用。创制突变体的主要方法，通常有自发突变、理化诱变和插入突变等三种方法。自发突变，是自然界中生物经过自然选择和人工选择的长久积累形成的，其形成时间漫长，突变频率很低，遗传背景异常复杂，难以满足高通量、大规模功能基因组学研究。理化诱变，包括物理诱变和化学诱变，前者如伽玛射线、快中子等，后者如EMS(甲基磺酸乙酯)等，直接处理植物种子。理化诱变产生的突变体中，会出现大量嵌合体，给研究带来困难。插入诱变，主要是插入转座子或T-DNA。其缺点是农杆菌介导的T-DNA转化过程耗时长，花费大，而且突变体中常有嵌合体以及不能鉴定多个拷贝的功能基因，因为通过诱变破坏其中一个基因并不能导致生物异常发育。

因此如何克服上述诱变存在的缺陷，获得一种更好的创制小麦生理型突变体的方法，成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种利用关键酶抑制剂来创制小麦生理型突变体的方法，该方法采用甲羟戊酸代谢途径中的HMGR和FPPS两个关键酶，在小麦生长发育过程中，通过分别添加相应关键酶的抑制剂，抑制植物体内已经表达的关键酶活性，阻止其参与的催化反应，模拟关键酶基因的功能缺失；采用这种处理等同于创制植物关键酶基因的突变体，使其产生无催化活性的酶蛋白分子，进而对植物的表型产生影响，从而达到验证植物体内关键酶基因功能的目的，这种方法操作简便，创制的生理型突变体表型明显，易观察、易测定；不需要复杂的转基因技术；避开了利用RNAi技术敲除小麦基因组中存在的功能基因，使其功能完全失活或对功能基因敲除不够彻底的技术屏障；本发明也可应用于利用代谢途径相应关键酶抑制剂创制其他植物生理型突变体。

本发明中所采用的抑制剂为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂洛伐他汀(mevinolin)和法呢基焦磷酸合酶抑制剂阿仑唑奈(alendronate)。

本发明还提供了具体的小麦生理型突变体的创制方法如下：

小麦幼苗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制突变体的创制：

取济麦22种子，先用70vt﹪酒精浸泡清洗，然后用灭菌去离子水清洗2遍，培养皿中铺一层滤纸，放入灭菌后的种子，并加入去离子水置于25℃恒温培养箱中，萌发4d后，待小麦幼苗根长到1.5cm左右时，取生长状态一致的小麦幼苗，转移到盛有0、2μM、5μM和8μM的mevinolin抑制剂的培养盒中，盒子上方铺设一层纱布，以保证幼苗的根浸泡到溶液中；每盒放置15棵幼苗，连续培养3d，期间要补充蒸发减少的水分至原来的水位，定时观察、记录小麦幼苗的生长状况。小麦材料抑制剂处理结束，用纯净水充分洗净、擦干，将茎叶和根部分开，锡箔纸包装，液氮速冻保存备用；

小麦幼苗法呢基焦磷酸合酶抑制突变体的创制：