[发明专利]循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法

权利要求书

1.一种循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，并用甲醛进行固定；

(2)先通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-CK进行阳性筛选，用PD-L1一抗孵育所有细胞，然后用标记有FITC荧光基团的PD-L1二抗孵育，再用细胞核荧光染料DAPI标记出所有细胞；

(3)采用高通量多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，最终实现对循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的具体反应条件如下：

a.向细胞固定后的培养皿中加入含4-6％脱脂奶粉的PBS溶液，4℃避光孵育40-70min；

b.吸除脱脂奶粉PBS溶液后，沿壁加入PBST清洗若干次；

c.向封闭液中加入肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-CK和PD-L1一抗，抗体来源为abcam公司，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；

d.吸除混合液，向封闭液中加入标记有FITC荧光基团的PD-L1二抗，抗体来源为abcam公司，混匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育40-70minh；

e.吸除抗体，用PBST清洗若干次，加入DAPI，常温避光孵育20-40min。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，条件b中，PBST中含0.02wt％Tween-20的PBS。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则PD-L1+，不显绿色则PD-L1-，显红色则CK+，不显红色则CK-；根据荧光显色，将DAPI+且CK+的点认为是循环肿瘤细胞CTC，若该循环肿瘤细胞CTC上存在PD-L1+，那么该循环肿瘤细胞CTC为PD-L1+CTC。