[发明专利]用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其鉴定方法

说明书

本发明公开了用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用，属于动物分子遗传学领域。本发明提供了中华鲟的双重PCR微卫星标记和利用该标记可以鉴定中华鲟个体之间的亲缘关系应用方法。利用本发明提供的微卫星标记可以快速鉴定个体之间的亲缘关系，避免了个体之间近亲繁殖。本发明提供的微卫星标记扩增结果具有高度的多态性和稳定性，并且本发明提供的双重PCR微卫星标记所消耗的财力和人力都比传统的PCR反应减少了一半，具有巨大的实用价值。

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用，属于动物分子遗传学领域。

背景技术

中华鲟是全世界20余种鲟科鱼类中分布纬度最低，体型最大的鱼，为我国特有的的物种。上世纪70年代，长江里的繁殖群体能达到1万余尾，由于环境污染、过度捕捞、栖息地丧失等诸多因素中华鲟已濒临灭绝。对濒危物种的保护不仅保护濒危物种的个体而且对濒危物种的基因也有进行了解和保护，进而制定良好的育种政策，防止近亲繁殖。但是直至今日对中华鲟的遗传性研究十分有限，急需从分子方向对中华鲟进行研究。

微卫星标记是目前研究濒危动物保护遗传学中最理想的一类方式，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。微卫星标记多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等优点。有关中华鲟的微卫星标记多重PCR国内外未见报道。本发明利用5组中华鲟微卫星标记的双重PCR反应体系实现了对中华鲟个体之间的亲缘关系的测量进而确定个体之间的亲缘关系，为中华鲟的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其在鉴定个体之间亲缘关系的应用方法。

技术方案

用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用的双重PCR微卫星标记引物如下：

用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用，其步骤为：取中华鲟组织样品；提取中华鲟样品DNA；利用所示的微卫星位点对中华鲟样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；根据各个个体的基因分型结果用NTsys软件画出各个个体之间的聚类分析图，确定个体之间的亲缘关系。

所述的PCR反应体系是25ul：10×PCR Buffer 2-3ul，2.5mmol/L dNTP 0.1-1ul，MgCl2 1-2ul，反应体系中两对引物的上下游引物各0.5-1.5ul，Taq酶0.1-0.5ul，DNA模板1-5ul，超纯水10-15ul。

所述的PCR反应体系是25ul：10×PCR Buffer 2.5ul，2.5mmol/LdNTP 0.5ul，MgCl2 1.5ul，反应体系中两对引物的上下游引物各1ul，Taq酶0.3ul，DNA模板3ul，超纯水13.2ul。

所述的PCR反应程序为：94℃预变性2-5min；94℃变性15-45s，退火温度56℃复性15-45s，72℃延伸15-45s，15-45个循环；72℃延伸8-15min；4℃保存。

所述的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

所述的PCR产物用质量浓度为8-15％的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：