[发明专利]一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高产L‑赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，替换大肠杆菌LATR11中DapD编码基因dapD为热纤维菌中DDH编码基因ddh_Ct，构建新的、高效的meso‑DAP合成途径并解决埃希氏属的L‑赖氨酸生产菌中异源的DDH热稳定性不足的缺点，增强重组菌株中meso‑DAP合成能力并提高菌株积累L‑赖氨酸的能力。重组菌经摇瓶发酵实验，L‑赖氨酸积累量达23.1g·L^‑1，最大比生成速率为0.75g·L^‑1·h^‑1，高于出发菌株的17.6g·L^‑1和0.44g·L^‑1·h^‑1。此发明成功改变了大肠杆菌中meso‑DAP合成途径，解决了外源DDH热稳定性不足的缺点，为选育L‑赖氨酸高产菌株提供崭新的思路。

技术领域

本发明涉及一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，是人类和动物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。由于L-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中。微生物发酵法因其具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点，而成为当今工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。因此，选育具有自主知识产权的高L-赖氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，实现企业可持续发展具有重要意义。

用于生产L-赖氨酸的微生物包括多种属，如棒状杆菌(如谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和钝齿棒杆菌)及其亚种(如黄色短杆菌和乳酸发酵短杆菌)、埃希氏菌(如大肠杆菌Escherichia coli)和芽孢杆菌(如浸麻芽孢杆菌)、古生菌(如热变形菌)以及真菌中的酵母菌(如隐球酵母)等。目前，国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为C.glutamicum及其亚种和E.coli的改造型菌株。在C.glutamicum和E.coli中，二氨基庚二酸(DAP)途径是其主要的L-赖氨酸生物合成途径。DAP途径是天冬氨酸族氨基酸合成途径中的一部分。以天冬氨酸为底物，DAP途径中有9个酶促反应涉及到L-赖氨酸的合成。DAP途径存在四种不同的变化形式用于合成meso-DAP，即(A)脱氢酶途径；(B)琥珀酰化酶途径；(C)乙酰化酶途径和(D)转氨酶途径(图1)。通常情况下，细菌中只存在四种DAP变化途径中的一种，如大肠杆菌只存在琥珀酰化酶途径。然而，一些革兰氏阳性菌，如谷氨酸棒杆菌同时存在脱氢酶途径和琥珀酰化酶途径。琥珀酰化酶途径经由四步酶促反应生成meso-DAP(即四氢吡啶二羧酸琥珀酰化酶DapD、琥珀酰-氨基-吡咯酮转氨酶DapC、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶DapE和二氨基庚二酸差向异构酶DapF)，然而脱氢酶途径只需经过一个酶促反应就可生成meso-DAP(即二氨基庚二酸脱氢酶DDH)。