[发明专利]重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体

说明书

本发明涉及一种重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体。一种重组酶UvsX的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。上述表达基因编码的重组酶uvsX基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的重组酶UvsX的纯度大于95％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体。

背景技术

DNA扩增在许多分子生物学检测方法中都是非常关键的一步。PCR是在1986年就发展起来的应用最为广泛的DNA扩增技术，常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。

随着分子生物学的不断发展，重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术使不借助精密温度循环系统进行等温核酸扩增逐渐成为可能。

重组酶聚合酶扩增技术通过模拟DNA体内扩增，在等温条件下产生目的片段，该技术主要依赖重组酶UvsX、单链结合蛋白Gp32和链置换DNA聚合酶Bsu。重组酶UvsX能够不通过加热就解开双链DNA。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶UvsX在ATP的参与下结合引物，形成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白Gp32与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶UvsX离开寡核苷酸的3’端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶Bsu结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。重组酶聚合酶扩增技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。

重组酶聚合酶扩增技术中重组酶UvsX具有重要作用，但目前能够获得的重组酶UvsX的纯度最高只能够达到50％，而且uvsX基因在基因工程菌中的表达量低，量产化成本高。

发明内容

基于此，有必要针对重组酶UvsX的纯度偏低且量少的问题，提供一种重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体。

一种重组酶UvsX的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

上述表达基因，编码的重组酶uvsX基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的重组酶UvsX的纯度大于95％。

一种重组表达载体，包括pET-28a载体和插入在所述pET-28a载体中的目的基因表达片段，所述pET-28a载体包括pET-28a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点，所述目的基因表达片段中含如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述BamHI酶切位点和所述SalI酶切位点之间。

一种重组酶UvsX的制备方法，包括以下步骤：

将目的基因表达片段导入pET-28a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端；

将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及

对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶UvsX。

在其中一个实施例中，在将目的基因表达片段导入pET-28a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：