[发明专利]特异性过敏原IgE的检测方法

说明书

本发明提供用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白，所述单域结合蛋白选自E02A2、E03B1、E04A1或E05A2，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑4所示，或SEQ ID NO:1‑4所示序列C端去掉6个His标签形成的序列。本发明还提供特异性过敏原IgE的微量免疫反应检测方法，该方法不同于传统的单抗或多抗在微量免疫检测上的使用模式，并且同时提升了检测的灵敏度、专一性，更提高了反应速率，大幅缩短了检测过程所需时间。应用于微量免疫反应检测，优化条件后的不同单域结合蛋白组合可以大幅改善微量免疫反应检测的性能。

技术领域

本发明涉及免疫学、分子生物学及临床医学检测领域，具体地说，涉及特异性过敏原IgE的检测方法。

背景技术

免疫检测技术(Immunoassay)，或称免疫诊断技术(Immuno-diagnostics)是利用抗原抗体之间的特异性免疫反应来测定免疫状态、检测各种疾病的诊断方法。现在最常使用的微量免疫检测，又能同时检测多项目的检测，包括蛋白质生物芯片，以及Luminex公司发展出的荧光微粒检测(Luminex xMAP)。基本上都是以免疫学方法原理，将抗体或抗原点制芯片表面的小点内，或者是包覆在荧光微粒上，可以迅速的与待测物反应，在一个反应中可以同时检测数十到数百个检测目标物。然而在这些同时多目标检测的试剂开发过程，常遇到的困扰是由于极度的微量化，使用的单株或多抗的标记物，发出来的信号极弱，必须要使用较高灵敏度的光学或其他检测仪来检测反应的结果。所以如何反应中以各种方式增加反应速率，或者增加短时间内的反应强度，将成为重要的研究方向。

由于免疫学的进展，1975年首度有学者提出，以融合瘤技术制造只针对单一抗原反应的单一种抗体，称之为单抗(monoclonal antibody)。1980年后，单抗因为蛋白质新药的发展而积极发展，再加上抗原结合位点(antigen-binding sites)概念被加入人源抗体IgG的Fc片段以后，显著的降低了单抗分子的大小，也增加了单抗药物的实用性。之后在生技界以及制药界，无不想尽办法找是否有更合适的分子，比单抗的更小更稳定的分子，并且能专一性结合在目标物上，如单链变异区段(singe chain variable freagment)。1989年，Hamers-Casterman等偶然发现单峰骆驼血液中有半数的抗体是重链抗体(heavy-chainantibodies,HCAbs)，它是一种缺失了轻链的重链二聚体抗体。1997年，Ghahroudi等利用噬菌体展示技术获得骆驼重链可变区片段(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因库，经多轮淘选后得到了只含有一个结构域的最小单元抗原结合蛋白片段，被称为单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs)。

单域抗体是抗体分子的最小抗原结合单元，仅由一个可变结构域或一个仅协助靶标结合的工程化的恒定结构域组成。此类抗体衍生物现今技术已知的，包括来源于骆驼科和鲨鱼类动物中天然产生的可变区，以及工程化的人源抗体中重链或轻链的可变区或恒定区结构域。单域抗体为约110个氨基酸的肽链，包含了一般完整抗体中的一个重链可变域(VH)。它们对抗原的特异性程度与完整的抗体相似，但热稳定性好，在清洁剂和高浓度尿素环境下稳定。在药物学上来说，相对于完整抗体，单域抗体的分子质量更低，这使其更容易渗透到组织中。同时由于更容易通过肾脏清除，因此其药代动力学半衰期也更短。此外由于它们没有可结晶区，因此无法通过补体系统引发细胞毒性。所以在药物学的研究和应用上，近20年来他的研究非常广泛，也有数个已经初期开发完成进入临床试验的单域抗体药物。