[发明专利]禽致病性大肠杆菌等的多重PCR检测引物组、方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法，引物组包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA‑F和PhoA‑R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT‑F和KMT‑R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD‑F和AtpD‑R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA‑F和PETA‑R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA‑F和InvA‑R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC‑F和NuC‑R。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法。

背景技术

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是危害养禽业的主要病原微生物。

禽致病性大肠杆菌感染禽类后，出现肝肿大、肠道粘膜出血和溃疡、心包发炎等症状，该菌血清型众多，存在广泛的耐药性,不易控制,由于防控过程中抗生素的大量使用，易造成禽产品中的药物残留,严重影响人体健康和导致公共卫生问题。

禽巴氏杆菌病又名禽霍乱，由多杀性巴氏杆菌引起。该病主要引发成年鸡出现急性败血性症状或传染性肺炎，具有较高的死亡率以及由此导致的生产性能低下等特点。

奇异变形杆菌是多发生于雏鸡，以肢体瘫痪和水样腹泻为主要特征的急性传染病。

绿脓杆菌主要危害10日龄内的雏鸡，以拉稀、呼吸困难、皮下水肿为特征，已成为威胁养鸡业发展的主要疾病之一。

沙门菌有2000多个血清型，部分血清型可以导致人和动物感染。由鸡白痢沙门菌所引起的称为鸡白痢，由鸡伤寒沙门菌引起的称为禽伤寒，沙门菌主要经卵传递，消化道、呼吸道和损伤的皮肤或粘膜感染，雏鸡发病率、死亡率最高。

金黄色葡萄球菌感染禽类后，病禽出现败血症、脐炎和关节炎等多种临床症状，该菌存在严重的多重耐药性，可通过皮肤外伤或黏膜破损而感染,也可以经呼吸道而感染。

目前对这些病原细菌的检测,主要依靠常规的细菌学培养方法,耗时长，操作繁琐，费时耗力。用于病原细菌检测的方法包括乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定法、核酸杂交和PCR技术等。PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛应用，但这些方法每次实验通常只能检测一种或几种病原细菌。

多重PCR(Multiplex PCR)技术是基于常规PCR发展来的DNA片段扩增技术，可实现在同一反应体系中检测多种病原菌。

发明内容

为了解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的引物组，其特征在于，包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA-F和PhoA-R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT-F和KMT-R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD-F和AtpD-R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA-F和PETA-R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA-F和InvA-R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC-F和NuC-R；

各个引物的核苷酸序列分别为：