[发明专利]一种表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计异戊烯基转移酶ComQ的引物

根据异戊烯基转移酶ComQ的碱基序列，以及载体pProEX-HTa的多克隆酶切位点，设计上下游引物并引入酶切位点；

(2)扩增异戊烯基转移酶ComQ目的基因

以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，向体系中加入上下游引物、Taq DNA聚合酶及缓冲液，进行PCR反应，切胶回收PCR产物；

(3)酶切酶连法构建重组质粒

将PCR产物和pProEX-HTa质粒用限制性内切酶进行双酶切，回收酶切产物，用连接酶将载体与目的基因连接得到重组质粒，用化学转化法将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有氨苄霉素的LB固体培养基中过夜培养；

(4)重组质粒的鉴定

挑取步骤(3)中单菌落接种于含有氨苄霉素的LB培养基中，恒温震荡培养后提质粒，利用双酶切方法初步检测并将质粒进行测序；

(5)化学转化法构建基因工程菌株

将测序成功的重组质粒用化学转化法转入E.coli BL21感受态细胞中，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基上，过夜培养，挑取单菌落接种于含氨苄霉素的LB液体培养基中，恒温过夜培养后保存，即得表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的上下游引物分别为F-ComQ：5’-GGGCCATGGATATGTGTTTAGATGCCGAA-3’、5’-GGGTCTAGATTATTTTTCATCCTCCTCTAA-3’。

3.如权利要求1所述的表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的应用，其特征在于，利用所述的基因工程菌体外表达异戊烯基转移酶ComQ。

4.如权利要求3所述的表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的应用，其特征在于，具体步骤如下：

(1)制备目的蛋白粗提液

将菌种接种到含有氨苄霉素的液体LB培养基中，震荡培养后，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导，随后收集菌体，缓冲溶液悬浮后超声破碎，离心、保存上清液作为粗提液备用；

(2)利用金属离子螯合层析对目的蛋白的粗提液进行初步分离纯化

将处理好的填料灌入低压层析柱中，用Washing buffer平衡柱子后加入粗提液，使目的蛋白与填料充分结合，然后用Washing buffer对杂蛋白进行洗脱，最终用Elutionbuffer将目的蛋白洗脱收集，利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳检测蛋白纯化效果；

(3)利用离子交换层析对目的蛋白进行分离纯化

先用高盐浓度的Buffer B清洗离子柱中残留的杂蛋白，再用Buffer A洗去柱子中的盐离子，平衡柱子后将镍柱纯化后的蛋白溶液灌入离子交换柱，用Buffer B、Buffer A的混合液对目的蛋白进行梯度洗脱，根据洗脱峰谱图，选择样品用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测分析，根据检测结果回收目的蛋白，浓缩备用；

(4)利用凝胶过滤层析法再次纯化目的蛋白

用凝胶过滤缓冲液平衡层析柱后进样，并对目的蛋白进行洗脱，根据洗脱峰谱图，选择对应蛋白样品用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测分析，根据检测结果回收对应的目的蛋白，浓缩后保存备用。

5.如权利要求4所述的表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的应用，其特征在于，步骤(1)所述菌种的接种量为1vt％。