[发明专利]一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA-/-T淋巴细胞的制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA^‑/‑T淋巴细胞的制备方法，该方法从肿瘤患者的外周血中分离得到T淋巴细胞，使用CRISPR‑Cas9技术，在体外将BTLA基因敲除，然后置于无血清培养基中培养，加入IFN‑γ、CD3单抗，IL‑2，IL‑1α，IL‑4，GM‑CSF和Puromycin，继续培养10～15天后，离心得到BTLA^‑/‑T淋巴细胞。本发明的BTLA^‑/‑T淋巴细胞的制备方法设计巧妙，制备得到的BTLA^‑/‑T淋巴细胞具有抵抗肿瘤免疫抑制微环境的特性，具有更佳的肿瘤杀伤效果，提高临床疗效，提供了新型的防癌治癌的手段。

技术领域

本发明涉及生命科学与医学的交叉技术领域，特别涉及基因编辑的免疫细胞，具体是指一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA^-/-T淋巴细胞的制备方法与应用。

背景技术

T淋巴细胞在体外免疫系统能够识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞，T淋巴细胞本身应是人体内抗肿瘤的“斗士”，但因各种原因，导致免疫耐受和逃逸，在体内不能有效地杀伤肿瘤细胞。

一个成型的肿瘤是一个复杂的组织，它不仅由肿瘤细胞组成，还包括也基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质，所有这些总和定义为肿瘤微环境。免疫治疗的抗性机制包括如下：(1)抑制性微环境或缺乏抗原刺激/协同刺激的免疫细胞，尤其是T细胞，可能会促使肿瘤的生长和免疫逃逸；(2)生物屏障对肿瘤组织的包裹可导致免疫细胞迁移进肿瘤部位的数量不足；(3)有限的抗原特异性T细胞群短暂激活或耗竭未能抑制肿瘤生长。

B及T淋巴细胞弱化因子(BTLA)是免疫协同刺激分子中的一种免疫抑制性受体，其功能是通过传递抑制信号阻止淋巴细胞的活化。肿瘤细胞通过表达HVEM(herpesvirusentry mediator)与T淋巴细胞表面的BTLA受体结合，传递负性信号，抑制T淋巴细胞的活化和增殖，导致T淋巴细胞丧失杀伤肿瘤细胞的能力，为肿瘤的免疫逃逸创造有利条件。

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)-Cas9是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA^-/-T淋巴细胞的制备方法与应用。

本发明的有益效果在于：

利用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑，选择性地敲除细胞基因中一种编码BTLA蛋白的基因，从而将T细胞潜在的对肿瘤细胞的攻击能力“激活”。在体外进行T细胞培养扩增后，再输回患者体内，用T细胞去攻击肿瘤细胞，达到预期的治疗目的。

附图说明

图1为BTLA-sgRNA-Cas9质粒设计图谱；

图2为BTLA-sgRNA-Cas9在HeLa细胞中的敲除作用的验证；其中，泳道1：BTLA^-/-293T细胞；泳道2：BTLA^-/+Hela细胞；泳道3：BTLA^-/+Hela细胞；泳道4：BTLA^-/+Hela细胞；泳道5：BTLA^-/-Hela细胞；泳道6：BTLA^+/+Hela细胞；泳道7：DNA marker。

图3为流式检测野生型T淋巴细胞、BTLA^-/-T淋巴细胞的BTLA受体表达情况；

图4为野生型T淋巴细胞、BTLA^-/-T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。