[发明专利]一种高效发酵生产重组细菌漆酶的方法

权利要求书

1.一种生产重组细菌漆酶的方法，其特征在于在产细菌漆酶的重组大肠杆菌发酵的0-2h加入1-10%v/v的甲醇或曲拉通或甲醇和曲拉通的组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于甲醇的添加时间为0-0.5h,添加量为4-8%v/v。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于甲醇的添加时间为0h，添加量为6% v/v。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于曲拉通的添加时间为0-0.5h,添加量为2-5%v/v。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于曲拉通的添加时间为0h,添加量为4% v/v。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于甲醇和曲拉通复合诱导剂的添加时间为0-0.5h,添加量为甲醇4-8% v/v，曲拉通2-5% v/v；且两者总和不超过10% v/v。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于甲醇和曲拉通复合诱导剂的添加时间为0h,添加量为甲醇6% v/v，曲拉通4% v/v。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）构建产重组细菌漆酶的大肠杆菌基因工程菌；

（2）将产重组细菌漆酶的大肠杆菌基因工程菌在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有卡那霉素的50ml LB液体培养基，180rpm 37℃培养过夜得种子液；其中，所述的卡那霉素终浓度为50ug/ml；

（3）取种子液转接到含卡那霉素的TB培养基；

（4）添加权利要求1-7任一项中的甲醇或曲拉通或甲醇和曲拉通的组合，30℃，180rpm，摇到OD600=1.0；

（5）加入IPTG和GuSO₄进行诱导，16℃，180rpm,20h；其中IPTG的终浓度为100ug/ml和GuSO₄终浓度为0.25mM；

（6）16℃静置22h；

（7）离心获得菌体和上清，上清为胞外酶，菌体用加有Cu²⁺终浓度1mM的Tris-HCl缓冲液进行重悬，超声破碎，75℃加热10min,4℃，10000×g离心30min收集上清，获得重组细菌漆酶的粗酶液。