[发明专利]一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重PCR检测引物组及试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重PCR检测引物组及试剂盒，该引物组是发明人根据GenBank中收录的PDCoV和BVDV序列，通过比对PDCoV和BVDV之间的差异，自行设计的特异性引物，该引物组能够对PDCoV和BVDV进行特异性扩增。在此基础上，发明人成功研制了专用试剂盒，先提取病毒RNA，并采用RT‑PCR方法鉴别检测PDCoV和BVDV，PDCoV预期扩增片段大小为525bp，BVDV预期扩增片段大小为185bp。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，对PDCoV和BVDV的最低检测量分别为1.0×10³拷贝/μL和1.2×10⁴拷贝/μL；特异性强，重复性好，能够广泛用于临床PDCoV和BVDV的检测。

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体涉及一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重PCR检测引物组及试剂盒。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，为单股正链有囊膜的RNA病毒，于2012年首次在香港的猪群中发现。随后在美国、加拿大、韩国也有报道检测出该病毒。我国大陆地区于2014年首次报道检测出该病毒。牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)，于1946年在美国首次报道。我国于1980年首次报道并且分离到病毒。BVDV除了感染牛以外，还可以感染猪、羊、牦牛、骆驼等野生动物。BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(genuspestivirus)，为单股正链有囊膜的RNA病毒。由于PDCoV和BVDV感染猪以后的临床表现、病理变化等非常相似，给临床诊断造成了一定困难。因此建立一种能够快速区分PDCoV和BVDV的多重PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PDCoV和BVDV，且灵敏度高、特异性强。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重PCR检测引物组，所述引物组包括4条特异性引物，具体为：

L1：5ˊ-ATCTCCCTAGCTTCGCTAGTTCTCTA-3ˊ

L2：5ˊ-ATAGCGTCGCGCTTGGACTTGTTC-3ˊ

L3：5ˊ-GGTGTGGAGGAACCTGTTTATGATCAG-3ˊ

L4：5ˊ-CCTTTACTATTACCCGACCTGCAGTCACCTC-3ˊ。

一种多重PCR检测在制备快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒试剂盒中的应用。

一种含有多重PCR检测引物组的快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。

试剂盒还包括病毒RNA的提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。

反转录试剂包括5×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、L2、L4引物。

反转录试剂所构建的反转录体系为：5×M-MLV缓冲液2.0μL、2.5mmol/L dNTP 2.0μL、200U/μL M-MLV反转录酶0.5μL、40U/μL RNase酶抑制剂0.3μL、10mmol/L L2、L4引物0.3μL、RNA模板4.9μL。