[发明专利]H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重RT‑PCR检测试剂盒，该试剂盒含有三对特异性引物。实验证明，应用本发明仅需一次RT‑PCR反应就能同时检测H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明最低能同时检出1pg H9亚型禽流感病毒RNA、50pg鸭坦布苏病毒RNA和10ng鸭圆环病毒DNA，为以上三种病毒的发病早期提供了准确的检测方法，对及时切断病毒的传播具有重要意义，具有广阔的应用前景，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义。

技术领域

本发明涉及RT-PCR检测技术领域，具体是一种H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒属中不同亚型病毒引起的禽类感染和疾病的总称。H9亚型禽流感病毒（H9AIV）普遍呈低至中等毒力，但它分布广泛、能造成鸭的免疫抑制进而引发与其它鸭病的混合感染，产蛋鸭感染后也可引起产蛋率的明显下降，极大影响了蛋鸭的经济效益，因此它对养鸭业的危害不可忽视。

鸭坦布苏病毒（DTMUV）首先发现于2010年中国福建、浙江、江苏等东部沿海地区，并逐渐蔓延至全国大部分地区。鸭坦布苏病毒感染鸭后可导致蛋鸭产蛋量严重下降，产蛋率可从90%降至10%以内，甚至绝产；感染雏鸭后可导致雏鸭出现站立不稳、倒地不起等神经症状，进而导致雏鸭淘汰率升高，严重地高达80%，给养鸭业带来了极大的经济损失。

鸭圆环病毒（DuCV）常见于鸭，鸭圆环病毒可造成鸭生长迟缓、羽毛凌乱、体重减轻等症状，可感染禽类的免疫系统，引起免疫抑制。

混合感染使得鸭疾病的诊断难度较大，不能仅通过临床表现做出诊断，须要借助于分子诊断技术。病毒的分离、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等方法均比较耗时，不利于鸭病的防治。

动物传染病确诊的传统方法主要通过病原的分离、电镜观察、血清学鉴定等方法，但该方法不利于动物疾病的早期诊断和快速控制。

分子生物学的兴起，RT-PCR技术因具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点已广泛应用于动物病原微生物的检测，尤其在临床若干病原混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和很高的实用价值。

在同一RT-PCR体系中由于存在若干模板和引物，因此，必须防止引物和模板之间的非特异性结合，以免非特性条带的出现。同时，目的片段的大小有合适的梯度和各引物退火条件尽可能相同，以确保各自扩增产物量相对平衡，条件摸索十分重要。

发明内容

本发明目的在于解决上述背景技术中提出的问题，提供一种高效率、低成本、敏感性好、特异性高、快速方便的H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重RT-PCR检测试剂盒，以及鉴定或辅助鉴定这三种病毒的引物对组。

本发明为达到上述目的，采用以下技术方案：H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重RT-PCR引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和引物2、引物3和引物4、引物5和引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

进一步，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为（2-1）:（2-1）:（2-1）:（2-1）:（1-0.5）:（1-0.5）。

更进一步，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为2:2:1:1:1:1。

上述H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重RT-PCR引物组在PCR扩增方面的应用，所述PCR扩增的退火温度为50.2-60℃。

进一步，所述PCR扩增的退火温度为53.4℃。