[发明专利]兔抗人PD-L1蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途

说明书

本发明公开了一种兔抗人PD‑L1蛋白的单克隆抗体，能够特异性地识别细胞表面表达的PD‑L1蛋白，表现稳定且效价高，与细胞内其它蛋白无交叉反应，具有一定的医学基础研究价值。本发明还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测PD‑L1蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明采用免疫组织化学的方法检测肿瘤细胞表面PD‑L1的表达，主要包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌，为是否使用PD‑1/PD‑L1抑制剂进行免疫治疗和肿瘤的预后判断提供科学参考，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种兔抗人PD-L1蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。

背景技术

细胞程序性死亡受体-配体1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)，属于I型跨膜蛋白，全长290个氨基酸，分子量约为40kDa。近年来，研究发现PD-L1在多种肿瘤细胞表面表达上调，这一现象与肿瘤的免疫逃逸相关。机体的免疫系统通常会识别肿瘤细胞并对其产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生，因而将肿瘤细胞杀死或排除。但机体对肿瘤的免疫排除作用受到免疫调节点的控制，其中最重要的调节点就是细胞程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1，PD-1)。当T细胞表面的PD-1识别肿瘤细胞表面的PD-L1，可以传导抑制性的信号，降低T细胞的增生，T细胞就不能发现肿瘤细胞，不能向肿瘤细胞发出攻击信号，导致肿瘤免疫逃逸的发生。同时，在肿瘤微环境中，PD-L1也是造成肿瘤细胞逃逸免疫监控的重要因子之一。一方面，肿瘤微环境存在的一些炎性细胞因子，如IFN-α，IFN-β，IFN-γ和TNF-α，可促进肿瘤细胞表面的PD-L1表达。另一方面，PD-L1还可促进肿瘤细胞发生上皮间质化而促进肿瘤的转移和浸润。研究和临床试验结果显示，利用PD-1/PD-L1抑制剂阻断PD-1/PD-L1信号通路，恢复T细胞的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果。但这一疗法仅对于存在PD-L1高表达的肿瘤具有理想的疗效，对于无PD-L1高表达的肿瘤疗效甚微，且具有副作用。因此，研制出一种特异性高、表现稳定的PD-L1抗体，用于检测肿瘤表面PD-L1的表达，对于后续是否使用PD-1/PD-L1抑制剂进行免疫治疗具有重要意义。

目前，国际上对于选择合适的PD-1/PD-L1抑制剂需要相应的PD-L1检测方法，鉴于每种检测所使用的PD-L1抗体和技术都不同，在使用这些抗体进行辅助诊断时费用较高，同时在配套仪器和应用方面受国外供应商限制。而国内研发的PD-L1抗体稀少，特异性和亲和力方面均有待提高，因此亟待研发新的性能优异的抗PD-L1单克隆抗体，填补国内本行业的空白，降低治疗费用，减轻病人负担。本发明成功研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的兔源PD-L1蛋白的单克隆抗体，可用于不同免疫细胞和肿瘤细胞PD-L1的表达水平研究，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究以及PD-L1调节机体免疫功能的机理研究，具有一定的医学基础研究价值。本发明采用免疫组织化学方法(IHC)检测肿瘤细胞表面PD-L1的表达，主要包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌，为是否使用PD-1/PD-L1抑制剂进行免疫治疗及肿瘤的预后判断提供科学参考，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗PD-L1蛋白的单克隆抗体，及该抗体在制备用于检测PD-L1蛋白的免疫组织化学检测工具中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性结合人PD-L1蛋白的单克隆抗体。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)免疫源的制备：根据PD-L1基因(BC113734)序列信息，订购合成N末端带BSA序列(提高多肽的免疫原性)的人类PD-L1多肽(加拿大应用生物材料有限公司，AppliedBiological Materials Inc.)，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。