[发明专利]一种新型阿魏酸酯酶及其编码基因和应用

说明书

本发明提供了一种来源于土壤的新型阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将该酯酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化后的重组酶(FAE‑Xuan)分子量大小为29kDa。FAE‑Xuan对底物阿魏酸甲酯的催化活性最高，酶活为40U/mg，其最适温度为30℃，最适pH为5.0。在pH 3.0‑10.0下反应4h后，该酶仍能保持75％以上的活性，显示出较强的pH稳定性。本新型阿魏酸酯酶FAE‑Xuan对金属离子和有机溶剂的耐受性较好。底物利用偏好性及系统发育分析表明FAE‑Xuan属于A型阿魏酸酯酶。本发明中FAE‑Xuan的这些良好酶学性质，使其在食品、制药和饲料等领域的工业生产中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用宏基因组文库功能筛选的方法从土壤样品中获得一种新型阿魏酸酯酶，其编码基因及其应用。

背景技术

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，在植物细胞壁降解过程中起关键作用，能使阿魏酸和与之结合的单糖或低聚糖释放出来。释放出的阿魏酸具有许多良好的生理功能，如：抗癌、抗血栓、抗动脉粥样硬化和清除自由基等。此外，FAE在食品、制药、造纸和饲料工业也有广泛的应用前景。

FAE来源广泛，普遍存在于植物、真菌和细菌中，植物中的FAE一般含量较低，研究较少，而真菌和细菌中FAE较为丰富，研究比较深入。研究FAE的方法一般有直接发酵提取法和异源表达法，前者是以羟基肉桂酸酯类化合物(如阿魏酸酯、阿魏酸糖苷、对羟基-香豆酸酯、咖啡酸酯、介子酸酯等)为底物筛选产FAE的活性菌株，并从该菌株的发酵产物中得到FAE，然而，大多数野生菌株产FAE能力很低，如黑曲霉发酵后酶活仅在0.01-0.096U/mL之间，大大限制了该酶在工业中的应用；后者是通过基因工程方法，分子克隆FAE的基因并在合适的宿主中表达，然后分离纯化得到酶，与直接发酵提取法相比，异源表达法能显著提高酶的产量和酶的活性，目前已经有多种FAE在异源宿主(如大肠杆菌、丝状真菌、毕赤酵母等)中成功实现表达。

然而研究表明，在现有实验条件下仅有极少数的微生物可被培养，超过99％的微生物都是不可培养的，极大限制了新型阿魏酸酯酶的开发与利用。随着分子生物学和生物信息学的发展，宏基因组学技术逐渐成为研究不可培养微生物的有效手段。宏基因组学技术是不依赖培养为基础的微生物研究方法，该方法避开了传统微生物的分离培养问题，直接提取环境中的总DNA转化克隆到可培养的宿主中，形成重组DNA文库，使文库中既包含了可培养微生物的基因又包含了不可培养微生物的基因，文库基因经过筛选后，异源表达获得目标产物。

宏基因组学在新型FAE筛选和发现方面有多项成功报道，这些新酶大多来源于不可培养的未知微生物，与已知酶基因相比，序列相似性较低，活性更高。如Cheng等人采用宏基因组学方法，从荷斯坦奶牛瘤胃菌群中筛选到一种新的FAE FAE-SH1，编码酶蛋白与已知FAE相比，仅有56％的相似性，对4种羟基肉桂酸甲酯具有水解作用，说明该酶对底物具有宽广的特异性，酶经纯化后活性高达259.5U/mg，是现有最高FAE酶活性(来源于嗜酸乳杆菌L.acidophilus IFO13951)的251倍，该酶与木聚糖内切酶、葡聚糖酶、果胶酶一起使用，能够显著提高麦草中阿魏酸的释放量。这些优良的性质说明FAE-SH1在生物质降解、饲料生产和促进人体健康方面有巨大的潜力，充分说明宏基因组学是挖掘和发现新型FAE的一种有力工具。

发明内容

本发明从土壤宏基因组文库中筛选到一种新型阿魏酸酯酶基因，并对该基因进行了异源表达，重组酶具有较高的酶活、酸性、pH稳定性、对大多数金属离子和有机溶剂有耐受性等特点，可广泛应用于食品、制药与饲料等工业领域。

本发明的第一个目的在于提供一种新型阿魏酸酯酶。

本发明的第二个目的在于提供编码上述新型阿魏酸酯酶的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述基因的宏基因组学筛选方法。