[发明专利]一种转化质粒的方法

说明书

本发明公开了一种转化质粒的方法，涉及分子生物学领域及基因工程领域。本发明公开的转化质粒的方法，其包括：将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合。通过将宿主细胞的ygiZ基因敲除，提高转化率，该方法具有转化效率高，对大质粒转化效率高的特点，相对于野生型宿主细胞，ygiZ基因敲除的宿主细胞对质粒pUC19的转化效率增加了2.05倍，对质粒pET‑32a的转化效率增加了2.60倍，对质粒p1304的转化效率增加了1.67倍。该方法极大地提高了质粒转化效率，对分子生物学领域及基因工程领域具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于分子生物学领域及基因工程领域，具体涉及一种转化质粒的方法。

背景技术

CaCl₂法制备大肠埃希菌(Escherichia.coli)感受态细胞是分子生物学实验中最基本、最常用的操作技术之一，广泛的运用于重组质粒的转化、基因克隆以及基因文库构建等研究。虽然在理论上CaCl₂法制备的感受态细胞最理想的转化效率可达5×10⁶～2×10⁷cfu/μg DNA，然而，在实际操作中转化率常低于10⁵，有时甚至低达10³，无法满足相关实验研究需要。

发明内容

针对上述已有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种转化质粒的方法。采用该方法进行质粒的转化，具有较高的转化率，可有效解决在实际操作中质粒转化效率低的问题。

为解决上述问题，本发明是这样实现的：

一种转化质粒的方法，其包括：质粒转化步骤；上述质粒转化步骤包括：将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合。

ygiZ基因位于大肠杆菌基因组的第3171879位-3172211位，由332个碱基构成，且该基因仅存在大肠杆菌中。其编码蛋白ygiZ的Id为NP_417499.1，其一级结构由110个氨基酸组成；二级结构由61.82％α-螺旋、20.00％延伸链、5.45％β-转角和12.73％无规则卷曲组成，具有较强的疏水性，为内膜蛋白。

本发明的研究首次发现，相较于野生型宿主细胞，将宿主细胞的ygiZ基因敲除，可以提高其外源质粒的转化效率。基于该成果，在转化质粒的过程中，将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合，进行转化，可以提高目标外源质粒的转化效率，满足相关实验研究需要，对分子生物学领域及基因工程领域具有十分重要的意义。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在质粒转化步骤之前，上述方法包括：ygiZ基因敲除步骤；上述ygiZ基因敲除步骤包括：将打靶片段与感受态的野生型宿主细胞混合；上述打靶片段的两端含有与ygiZ基因同源的同源臂序列。

需要说明的是，上述的基因敲除方法采用的同源重组的方式敲除ygiZ基因，但在其他的一些实施例中，也可采用其他的基因敲除方式例如敲除ygiZ基因，无论通过何种方式敲除ygiZ基因例如完全敲除、部分敲除、甚至是通过RNAi干扰载体抑制ygiZ基因表达使其失活等方式，只要是在质粒的转化过程中使宿主细胞的ygiZ基因不发挥其功能的方式均属于本发明的保护范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述打靶片段还含有筛选标记基因。

为了使被敲除ygiZ基因的宿主细胞易于后续实验中被筛选出，在打靶片段中引入筛选标记基因是有利的。通过筛选标记基因可以方便操作者筛选出阳性重组子。筛选标记基因的类型可以根据具体需求选择，例如包括但不限于抗生素抗性基因、荧光筛选标记基因等。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述筛选标记基因为抗生素抗性基因。