[发明专利]复合微生物除臭剂的制备方法、除臭剂及其使用方法

权利要求书

1.一种复合微生物除臭剂的制备方法，其特征在于：它包括：以下步骤：

（一）环保酵素的制备

准备红糖或糖蜜9kg、酵母膏1kg、水果或果皮20-30kg和纯净水100L；将红糖或糖蜜和酵母膏在不高于40℃的温开水溶化成糖水，水果或果皮用自来水清洗干净，酵素发酵罐清洗干净，并用60%～80%乙醇擦一遍酵素发酵罐；然后依次加入水果或果皮、上述糖水和纯净水，密封发酵罐自然发酵30～100天后；得到的环保酵素溶液中活菌总数为3.0×10¹⁰cfu/ml— 5.0×10¹⁰cfu/ml，PH为3.5～4；

（2）光合菌种子液的制备:

（a）光合菌在斜面培养基的培养

向3L的烧杯中依次加入乙酸钠3.5g、氯化铵1g、氯化镁0.1g、氯化钙0.1g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.6g、酵母膏0.1g和纯净水800mL，搅拌溶解后煮沸加入琼脂20g,充分搅拌使琼脂溶解，然后用纯净水定容至1000mL，调节PH值至7±0.2；将配制好的培养基分装至50ml的试管中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；灭菌后将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基；在无菌操作下，用无菌微量吸管，吸取50μL无菌水放入瓶中，再购买光合菌菌种放入上述瓶中摇匀，然后用接种环高密度地接种光合菌菌种于上述的斜面培养基上，在30～33℃条件下，活化18～24h，得到活化后的光合菌菌种；

(b) 光合菌在液体培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入乙酸钠3g、氯化铵2g、氯化钠0.1g、氯化钙0.05g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.02g、三氯化铁0.002g和酵母膏0.1g,用纯净水溶解并定容至1000mL，调节PH值至6.5±0.2；将配制好的液体培养基分装至250ml的锥形瓶中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；将(a)活化后的光合菌菌种接种至(b)中液体培养基中培养，培养的液体称为菌悬液,菌悬液在温度34～38℃条件下，在100～150r/min摇床中培养40h～50h后，检测各个菌悬液OD600的光密度，当各个菌悬液OD600的光密度等于或大于4.0时，停止培养，此时得到活菌数量为3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的光合菌种子液；

（3）酵母菌种子液的制备

（c）酵母菌在斜面培养基的制备

向3L的烧杯中依次加入葡萄糖20g、酵母膏10g、蛋白胨20g和纯净水800mL，搅拌溶解后煮沸加入琼脂20g，充分搅拌使琼脂溶解，用纯净水定容至1000mL，调节PH值至6.5±0.2；将配制好的培养基分装至50ml的试管中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；灭菌后将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基；在无菌操作下，用无菌微量吸管，吸取50μL无菌水放入瓶中，再购买酵母菌菌种放入上述瓶中摇匀，然后用接种环高密度地接种酵母菌菌种于上述的斜面培养基上，在30～33℃条件下，活化18～24h，得到活化后的酵母菌菌种；

(d) 酵母菌在液体培养基的制备

向3L的烧杯中依次加入葡萄糖9g、糖蜜45g、麸皮34～38g、玉米DDGS3g、棉籽粕2.75g、酵母膏0.75g、硫酸铵0.8g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁0.3g和氯化钙0.3g,用纯净水溶解并定容至1000mL,调节PH值至6.5±0.2；将配制好的液体培养基分装至250ml的锥形瓶中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；将(c)活化后的酵母菌菌种接种至(d)中液体培养基中培养，培养的液体称为菌悬液,菌悬液在温度34～38℃条件下，在100～150r/min摇床中培养40h～50h后，检测各个菌悬液OD600的光密度，当各个菌悬液OD600的光密度等于或大于4.0时，停止培养，此时得到活菌数量为3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的酵母菌种子液；

（4）乳酸菌种子液的制备

（e）乳酸菌在斜面培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入蛋白胨5g、玉米浆2g、蔗糖40g、乙酸钠5g、氯化钠10g、硫酸镁5g和纯净水800mL,搅拌溶解后煮沸加入琼脂20g,充分搅拌使琼脂溶解，用纯净水定容至1000mL，调节PH值至7±0.2；将配制好的培养基分装至50ml的试管中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；灭菌后将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基；在无菌操作下，用无菌微量吸管，吸取50μL无菌水放入瓶中，再购买乳酸菌菌种放入上述瓶中摇匀，然后分别用接种环高密度地接种乳酸菌菌种于上述的斜面培养基上，在30～33℃条件下，活化18～24h，得到活化后的乳酸菌菌种；

(f) 乳酸菌在液体培养基的制备

向3L的烧杯中依次加入蛋白胨10g、牛肉膏8g、酵母膏4g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温～801g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g和硫酸锰0.04g，用纯净水溶解并定容至1000mL，调节PH值至6.0±0.2；将配制好的液体培养基分装至250ml的锥形瓶中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；将(e)活化后的乳酸菌菌种接种至(f)中液体培养基中培养，培养的液体称为菌悬液,菌悬液在温度34～38℃条件下，在100～150r/min摇床中培养40h～50h后，检测各个菌悬液OD600的光密度，当各个菌悬液OD600的光密度等于或大于4.0时，停止培养，此时得到活菌数量为3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的乳酸菌种子液；

（5）放线菌种子液的制备

（g）放线菌斜面培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g和纯净水800mL,搅拌溶解后煮沸加入琼脂15g，用纯净水容至1000mL,调节PH值至7.2±0.2；将配制好的培养基分装至50ml的试管中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；灭菌后将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基；在无菌操作下，用无菌微量吸管，吸取50μL无菌水放入瓶中，再购买放线菌菌种放入上述瓶中摇匀，然后用接种环高密度地接种放线菌菌种于上述的斜面培养基上，在30～33℃条件下，活化18～24h，得到活化后的放线菌菌种；

（h）放线菌液体培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入葡萄糖10g、酵母膏4g、蛋白胨4g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾2g和硫酸镁0.5g，用纯净水溶解并定容至1000mL，调节PH值至6.5±0.2；将配制好的液体培养基分装至250ml的锥形瓶中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；将(g)活化后的放线菌菌种接种至(h)中液体培养基中培养，培养的液体称为菌悬液,菌悬液在温度34～38℃条件下，在100～150r/min摇床中培养40h～50h后，检测各个菌悬液OD600的光密度，当各个菌悬液OD600的光密度等于或大于4.0时，停止培养，此时得到活菌数量为3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的放线菌种子液；

（5）芽孢杆菌种子液的制备

(i)芽孢杆菌斜面培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入蛋白胨10g、牛肉膏15g、氯化钠15g和纯净水800mL,搅拌溶解后煮沸加入琼脂18g，用纯净水定容至1000mL,调节PH值至7±0.2；将配制好的培养基分装至50ml的试管中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；灭菌后将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基；在无菌操作下，用无菌微量吸管，吸取50μL无菌水放入瓶中，再购买芽孢杆菌菌种放入上述瓶中摇匀，然后用接种环高密度地接种芽孢杆菌种于上述的斜面培养基上，在30～33℃条件下，活化18～24h，得到活化后的芽孢杆菌菌种；

(j) 芽孢杆菌液体培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入玉米淀粉20g、玉米浆10g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和氯化钠1g，用纯净水溶解并定容至1000mL，调节PH值至6.5±0.2；将配制好的液体培养基分装至250ml的锥形瓶中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；将(i)活化后的芽孢杆菌种接种至(j)中液体培养基中培养，培养的液体称为菌悬液,菌悬液在温度34～38℃条件下，在100～150r/min摇床中培养40h～50h后，检测各个菌悬液OD600的光密度，当各个菌悬液OD600的光密度等于或大于4.0时，停止培养，此时得到活菌数量为3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的芽孢杆菌种子液；

(6) 醋酸菌种子液的制备

（k）醋酸菌斜面培养基的制备：向3L的烧杯中依次加入葡萄糖10g、酵母粉10g、碳酸钙10g和纯净水800mL,搅拌溶解后煮沸加入琼脂25g，用纯净水定容至1000mL,调节PH值至6.5±0.2；将配制好的培养基分装至50ml的试管中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；灭菌后将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基；在无菌操作下，用无菌微量吸管，吸取50μL无菌水放入瓶中，再购买醋酸菌菌种放入上述瓶中摇匀，然后用接种环高密度地接种醋酸菌菌种于上述的斜面培养基上，在30～33℃条件下，活化18～24h，得到活化后的醋酸菌菌种；

(l) 醋酸菌液体培养基的制备：

向3L的烧杯中依次加入葡萄糖10g、酵母粉10g和食用酒精10ml，用纯净水溶解并定容至1000mL，调节PH值至5.5±0.2；将配制好的液体培养基分装至250ml的锥形瓶中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃～125℃条件下高压12～16min；将(k)活化后的醋酸菌菌种接种至(l)中液体培养基中培养，培养的液体称为菌悬液,菌悬液在温度34～38℃条件下，在100r/min～150r/min摇床中培养40h～50h后，检测各个菌悬液OD600的光密度，当各个菌悬液OD600的光密度等于或大于4.0时，停止培养，此时得到活菌数量为3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的醋酸菌种子液；

（7）制备混合微生物发酵液

将1kg红糖溶于9L蒸馏水中，制得红糖培养基；分别取步骤（2）至(6)的20%～40%体积的光合菌种子液、10%～30%体积的酵母菌种子液、5%～15%体积的乳酸菌种子液、5%～15%体积的放线菌种子液、5%～15%体积的芽孢杆菌种子液和5%～15%体积的醋酸菌种子液混合成复合微生物接种至上述红糖培养基中，在20～25℃条件下密封发酵7-10天，得到活菌数量为3.0×10¹⁰cfu/ml～4.0×10¹⁰cfu/ml的混合微生物发酵液；

（8）环保酵素和微生物发酵液的混合

将步骤（1）得到的环保酵素过滤后，按照体积比0.5～1: 1～1.5的比例，将上述环保酵素与步骤（7）得到的混合微生物发酵液混合均匀即得复合微生物除臭剂；所得到的复合微生物除臭剂中活菌总数为3.5×10¹⁰cfu/ml/ml～4.5×10¹⁰cfu/ml。