[发明专利]一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法

说明书

本发明提供了一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，包括将目标菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液离心、洗涤后，用磷酸盐缓冲液重悬，获得细菌悬液；配制培养基，其中培养基中含有趋化诱导物、M9盐溶液和琼脂，趋化诱导物的浓度为1~7.5mM；将培养基倒入培养皿中，得半固体平板；将滤纸放置在半固体平板中心，取细菌悬液接种至滤纸片上，在28~37℃培养36~48h；其中，趋化诱导物为使植物定植于土壤中，植物分泌的糖、氨基酸、有机酸以及次级代谢物。相对于现有技术，本发明实验现象明显直观，可比性高，可一次对多种有机物进行比较，操作简便，化学试剂消耗少。

技术领域

本发明属于细菌的趋化性研究技术领域，更具体地，涉及一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法。

背景技术

细菌趋向性是指有运动能力的细菌对环境中的刺激物做出靠近吸引物（正趋化性）和远离排斥物（负趋化性）的行为。正趋化性使细菌趋进有较高有机物浓度的地方，这对细菌寻找能量来源、促进自身繁殖十分重要。

细菌利用复杂有效的趋化系统趋向有利条件，增加对环境的适应性。目前相关研究大部分集中于细菌趋化性在植物根际定殖中的可能作用，趋化性在植物和细菌的相互作用过程中起着重要作用。杨姗姗等研究认为细菌趋化性机制为有运动能力的细菌，其膜表面存在各种具有专一性的化学受体、细菌可以通过它们检测到胞外环境中化学物质浓度的变化，并通过胞内的信号传递系统将感应到的化学信息转变成细胞内的信号，进而由这种信号控制细菌鞭毛的运动方向，产生相对应的趋化性运动。植物分泌的糖、氨基酸、有机酸以及次级代谢物，都可能是与植物相互作用的细菌的趋化诱导物。

细菌趋化性在诸如原位生物除污、生物膜的形成、感染的发病机制、固氮化作用、微生物在地下环境和土壤中的迁移以及微生物采油等领域的研究中具有重要意义。

植物根系分泌物中含有大量的有机物质，不仅为根际微生物的繁殖提供营养物质，同时还可作为信号分子调控根际微生物的群体结构。植物促生根际细菌菌株成功定殖根表是其发挥作用的关键，当环境中营养物质存在一定浓度梯度时，细菌出于适应环境的本能而表现出趋化性。De Weert等报道荧光假单胞菌WCS365（Pseudomonas fluorescens）对有机酸有一定的趋化作用。Rudrappa等研究报道植物根系分泌的 L-苹果酸可特异性吸引枯草芽胞杆菌 FB17。在原位生物除污领域，Pooja Singh等和Zaval’skii等人分别研究认为细菌趋化性可用于加强细菌对金属污染和萘的代谢作用，从而达到对环境修复。Li等人研究发现嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的耐药菌株的趋化性比非耐药性菌株有所降低，该发现有助于未来开发更有效的治疗方法。在基因组学领域，Wang, J等研究发现hygrocin C改变了与细菌趋化性和鞭毛相关的几个基因的转录，因此hygrocin C可以作为一种生物膜抑制剂。微生物采油领域原油黏附性菌株对原油的黏附作用可在10min以内产生；该菌株具有趋化性，可促使菌体“趋化带”现象产生。添加适量的生物表面活性剂和化学表面活性剂能显著促进菌体向原油表面聚集，促进了“趋化带”的产生，从而达到对采油微生物激活调控的目的。

目前，已有较多验证微生物趋化性的试验方法。如凌宁使用类毛细管法来检测多粘类芽孢杆菌SQR21对西瓜根系分泌的不同有机酸的趋化性；Lebenko等采用改进的诱导物琼脂柱法检测苏云金芽孢杆菌S变体和R变体对不同无机物和有机物以及松柏科的树的松针或树叶提取物的趋化性；胡小加等采用平板趋化法研究巨大芽孢杆菌A6对油菜根系分泌的有机酸和糖类的趋化性。然而这些方法所得到的实验现象不明显、不理想，且难以比较。操作方法较为繁琐，容易因操作不当引起误差。

发明内容

为克服现有验证趋化性方法一个培养皿只能验证一种有机物，对于细菌对有机物之间趋化性大小可比性不大，实验条件难以控制一致的问题，本发明提供了一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法。