[发明专利]D型流感病毒荧光定量PCR引物对及试剂盒

说明书

本发明提供了一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对及试剂盒。所述引物对是根据Gen Bank上四个JQ922306、KM392476、KM392483、KX768825已公布的D型流感PB1序列，截取中间保守序列而设计。该引物对可用于制备D型流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒，从而对D型流感病毒(IDV)进行病毒含量的检测。该试剂盒包括所述试剂盒由如权利要求1所述的引物对、阳性标准质粒、TB Green^TM Premix Ex Taq Ⅱ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成。用本发明的引物对制备的D型流感病毒(IDV)实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对D型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对及试剂盒。

背景技术

流感是流感病毒(Influenza Virus)引起的严重危害公共卫生和畜牧业发展的人畜共患传染病。以前根据核蛋白的抗原性可将流感病毒分为3类：A型、B型和C型流感病毒(IAV、IBV、ICV)。近几年来又发现了一种新型流感病毒的存在。2011年，在俄克拉荷马州，从流感疾病的猪中分离出一种属于假定新属的病毒株，尚未被官方分类所承认，并初步确定了流感病毒D(IDV)。2016年9月国际病毒分类委员会执委会批准命名了一种新病毒—D型流感病毒。IDV是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属的成员，主要侵害呼吸道。IDV是一种单链负反义RNA病毒，具有7个预测编码9种蛋白质的基因组片段，包括糖蛋白血凝素-酯酶融合(HE)，聚合酶PB2，PB1和P3，核蛋白，基质蛋白(M1和CM2)，和非结构蛋白(NS1和NEP)。D型流感是由IDV引起的接触性病毒性传染病，主要感染猪、牛等，尽管它首次从猪身上分离出来，随后流行病学、血清学和病理学研究表明，牛作为这种新发现的病毒的储库宿主，血清学调查表明，牛是血清流行率最高的物种，IDV抗体滴度最高。随后有报道从美国、中国、法国、意大利、墨西哥和日本的牛中分离出IDV毒株。实验研究证明，IDV也可以感染豚鼠和雪貂，并在其呼吸道中复制。此外，在北美小反刍动物血清中检测到特异于IDV的抗体。在人类中，尽管普遍血清学阳性率较低，但最近的一项研究显示，94～97％的接触牛的工作者具有针对IDV的特异性抗体，此项研究引发人们对可能的动物传染病的担忧。目前国内外公布的快速、准确的检测方法鲜有报道，国际常用检测方法是：血清学试验、病原分离试验、核酸序列分析等。但病毒分离与鉴定操作时间较长，限制了这些方法的推广应用。核酸序列分析需要大量的时间而延误了处理时机。国外曾有报道利用RT-PCR的探针法来检测D型流感病毒，但由于合成探针的成本过高，不利于实际生产上的应用。

发明内容

本发明旨在提供一种实时荧光定量PCR检测D型流感病毒的引物对。

本发明所采取的技术方案是：

一种D型流感病毒荧光定量PCR引物对，包括IDV-F：5′-AAGGAACTGTTACTGGACTGG-3′(SEQ ID№1)和IDV-R：5′-GCAAGCACCCGTAGGATTTTT-3′(SEQ ID№2)。所述引物对是根据Gen Bank上四个JQ922306、KM392476、KM392483、KX768825已公布的D型流感PB1序列，截取中间保守序列而设计。

本发明的引物对可用于制备D型流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒，从而对D型流感病毒(IDV)进行病毒含量的检测。该试剂盒包括所述试剂盒由如权利要求1所述的引物对、阳性标准质粒、TB Green^TMPremix Ex TaqⅡ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；所述阳性标准质粒是由序列为SEQ ID№3所示的DNA片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒。