[发明专利]一种脑组织冰冻切片的制备方法

权利要求书

1.一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)组织取材及固定脱水：使用心脏灌流取脑法取出动物脑组织，使用多聚甲醛进行固定，然后利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水；

(2)冷冻预处理：将冰冻切片机和样品托提前预冷，用PBS溶液冲洗脑组织后用吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹，放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻，之后从快速制冷区域移出，等待处理；

(3)半包埋处理：在样品托上浅涂一层包埋剂打底，厚度为1mm，当包埋剂开始变白时，厚涂一层包埋剂，厚度为3mm，将脑组织小心迅速放入包埋剂中，浅浅包裹脑组织底部，上述操作均在冰冻切片机中进行。

(4)冰冻切片：将样品托固定于切片机探头上，作连续冠状冰冻切片；

(5)切片收集：将所需部位的切片收集于盛有冰冻保存液的6孔板内，每孔依次放入切片，每一部位均可收集6套切片，切片于-20℃长期保存。

2.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述组织取材及固定脱水的具体方法为：在动物左心室灌注4℃液体，液体为生理盐水和4％多聚甲醛溶液，先快速灌注生理盐水直至流出液澄清，后改为灌注4％多聚甲醛溶液，先快后慢，以动物全身僵硬为准，灌注后立即快速取出脑组织，放入提前放有4％多聚甲醛溶液的50ml离心管中进行后固定，固定后再利用10％、20％、30％蔗糖溶液进行梯度脱水，更换蔗糖溶液以脑组织完全下沉至管底为标准。

3.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述冷冻预处理的具体方法为：将冰冻切片机和样品托提前预冷，切片机内温度设置为-20℃，用PBS溶液冲洗脑组织后吸水纸拭干，修平脑组织，用锡箔纸包裹放在冰冻切片机快速制冷区域冰冻3-5分钟，之后从快速制冷区域移出，等待切片，之后对脑组织进行半包埋处理。

4.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，所述包埋剂为普通胶水。

5.根据权利要求1所述的一种脑组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述冰冻切片的具体方法为：将样品托固定于切片机探头上切片，在-20℃环境下作连续冠状冰冻切片，切片厚度为26微米。

6.将权利要求1～5任一项所述方法所得冰冻切片应用于免疫荧光染色中，其特征在于，步骤如下：

(1)复温：将所需切片取出，室温恢复半小时；

(2)漂洗：用自制挑片器将切片移入PBS中，振荡漂洗6次，每次5分钟；

(3)封闭：将切片移入提前加入1％BSA封闭液的12孔板中，室温缓慢振荡封闭1h；

(4)一抗孵育：切片移入提前加入一抗的12孔板，室温振荡孵育1h后移入4℃孵育过夜；

(5)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟；

(6)二抗孵育：切片小心移入提前加入二抗的12孔板中，室温缓慢振荡孵育2h，此后所有操作均在避光环境下进行；

(7)漂洗：切片小心移入PBS中，室温缓慢振荡漂洗3次，每次5分钟；

(8)贴片与封片：取适量PBS至载玻片，形成独立液滴，将荧光染色后的切片平铺于液滴上，用吸水纸小心吸走多余液体，自然充分晾干后滴加适量的防荧光淬灭封片剂，盖盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。