[发明专利]一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物及其检测方法

权利要求书

1.一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括针对BRAF基因V600E位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对BRAF基因V600E位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对BRAF基因V600E位点的特异性引物SEQ ID NO.3-4。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的3’端带有小沟结合物-非荧光性淬灭基团修饰；

优选地，所述探针的5’端带有荧光基团修饰；

优选地，所述野生型探针的荧光基团与突变型探针的荧光基团不同。

3.一种检测BRAF基因V600E的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样品的cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cfDNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样品包括石蜡包埋病理切片组织或外周血浆，优选为外周血浆；

优选地，步骤(3)所述ddPCR的反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取样品cfDNA的具体步骤如下：

(1’)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离；

(2’)采用两步纯化法对步骤(1)分离得到的血浆抽提cfDNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述分离的步骤为：将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述分离的离心转速为1200-1800g；

优选地，步骤(1’)所述分离的离心温度为0-4℃；

优选地，步骤(1’)所述分离的离心时间为8-12min。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2’)所述两步纯化法的步骤为：首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离，将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃，其中，离心的条件为1200-1800g，0-4℃离心8-12min；

采用两步纯化法对二次离心后得到的血浆抽提cfDNA，首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cf DNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果，ddPCR的反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的引物探针组合物；

优选地，所述试剂盒还包括野生型标准品、阳性标准品和不含dUTP的ddPCR预混液。