[发明专利]一种HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明提供的用于HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法，属于基因检测领域。所述的用于HLA基因扩增的引物组，分别根据HLA‑A基因的8个外显子区、HLA‑B基因的8个外显子区和HLA‑DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物；通过上述引物PCR扩增HLA基因，使得扩增产物的基因片段长度大于400bp，小于1.5kb，对模板的完整性要求降低，扩增效率高，扩增反应时间短，成本降低，可以满足大规模样本HLA基因的扩增或基因分型的需求。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于二代测序技术的HLA基 因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)，编码基因位 于6号染色体短臂上，全长约4000Kb，是目前所知人类最复杂的遗传多态 性系统，与人类的免疫系统功能密切相关。HLA又被称为移植抗原，是决 定移植排斥反应高低的重要因素。在进行器官移植时，供者和受者之间HLA 相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官患者长 期存活率就越高；反之，就越容易发生排斥反应。因此，对HLA进行高效 准确的分型对器官移植至关重要。

HLA基因分成三类：I类、II类和III类基因。其中，I类包括：HLA-A、 HLA-B、HLA-C基因；II类包括：HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、 HLA-DPA1、HLA-DPB1基因。

HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、 免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄 清其系统的组成、结构和功能，闸明了其理化性质和生物学作用。这些研 究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。

随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行 分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的 外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保 征。

HLA分型方法包括血清学分型法、细胞学分型法以及分子生物学分型 法。随着分子生物学技术的飞速发展，传统的血清学和细胞学分型方法已 逐步被分子生物学分型方法所取代。现阶段，HLA分子分型方法主要有： 多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，多聚酶链反应-序列 特异性引物(PCR-SSP)，多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应 (PCR-SSOP)，基因芯片和测序分型(PCR-SBT)等。PCR-SSP需要设计 出一整套基因特异性引物，通过PCR技术获得特异性产物，通过电泳分析 决定HLA基因型别。其缺点不易、不能检测新的等位基因；试剂盒需不断 升级；检测的信号也只说模拟的信号，不直观可靠。PCR-SSOP的原理：设 计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针，对PCR产物进行标记， 以PCR产物与探针进行杂交。通过检测信号判断HLA基因型别。但该方 法的缺点是不能检测新的等位基因，分辨率不高，检测信号为模拟信号。 SBT法是一种通过对扩增后的DNA进行一代测序，从而判断HLA基因型 别的方法。该方法是一种最直观、最准确的方法，可广泛用于HLA基因的 高分辨分型检测，但是该方法对扩增过程的引物序列要求很高，引物序列 直接关系到整个型别的确定，一对好的特异性引物是该方法成功的关键。

因此，为改变目前落后的HLA基因分型方法，需研发一种更加有效， 且在检测通量、数据质量、成本控制等方面，更有优势的方法。以Illumina 和Ion Torrent为代表的第二代测序技术(NGS)基于边合成边测序的原理，与 传统一代测序相比，具有样品制备简单、低成本、高通量、结果更准确等 优势。将二代测序技术应用于HLA分型，将大大降低检测成本，简化操作 步骤，使测序结果直观，能获得高分辨分型数据，还能得到新基因型等位 基因序列和等位基因的单倍体序列。

发明内容