[发明专利]基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以VP2或VP4重组蛋白为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述VP2重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述VP2重组蛋白以包涵体的形式存在，所述VP4重组蛋白以上清的形式存在。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记的抗鸭IgG。

5.一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包被酶标板：将纯化的VP2或VP4重组蛋白用包被液稀释后加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1h后，4℃过夜；

(2)洗涤酶标板：拿出包被好的酶标板，弃抗原液，用PBST洗板5次，5min/次，最后一次洗板后在滤纸上拍干孔内液体；

(3)封闭：向酶标板中加入封闭液，每孔250μL，37℃，封闭1h；

(4)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(5)将DHAV-3血清进行稀释，加入待检稀释的DHAV-3鸭血清一抗，100μL/孔，37℃，进行孵育；

(6)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(7)加入酶标二抗：

将HRP标记的抗鸭IgG稀释，加入稀释后的HRP标记的抗鸭IgG，每孔100μL，37℃，进行孵育；

(8)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(9)显色及终止显色：加入TMB显色液，100μL/孔，显色10min，加入等体积的2mol/LH₂SO₄终止反应，测定OD_450nm。

6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液；VP2重组蛋白的包被条件为蛋白1:1600稀释(2.23μg/mL)，重组蛋白VP4的最佳包被条件为蛋白1:2000稀释(2.6μg/mL)。

7.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，根据权利要求6所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的VP2重组蛋白的封闭液为1％的脱脂奶粉，VP4重组蛋白的封闭液为5％的脱脂奶粉。

8.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中的VP2重组蛋白的待检血清孵育时间为1h，DHAV-3血清按照1:160稀释；VP4重组蛋白的待检血清孵育时间为0.5h，按照DHAV-3血清1:20稀释。

9.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(7)中的VP2重组蛋白的酶标二抗按1:2000稀释，孵育时间为0.5h；VP4重组蛋白的酶标二抗按1:1600稀释，孵育时间为1h。

10.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体水平中的应用。