[发明专利]一种快速高效的PPCs细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种快速高效的PPCs细胞培养方法，包括以下步骤：步骤1：使用明胶稀释液过夜包被培养容器；步骤2：分离单个核细胞，然后洗涤、离心和重悬后分装备用；分离单个核细胞的洗涤和重悬过程，使用成纤维细胞的细胞上清液进行；步骤3：将所述步骤1处理的培养容器内的多余明胶吸除，并将步骤2中获得的单个核细胞接种到培养容器中，放置于氧浓度为0.5％‑7％的细胞培养箱中培养。培养细胞所使用的培养基中一半体积为成纤维细胞的细胞上清液，另一半体积为包含有10ng/ml SCF等的DMEM/F12培养基。本发明的培养方法对人体损伤较小，可以多次实施，同时分离得到的PPCs细胞活率高、增殖快。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种快速高效的PPCs细胞培养方法。

背景技术

可编程的多能细胞(Programmable Pluripotent Cells,PPCs)是一种通过现代细胞技术和分子生物学技术，开发成功的一种来源于外周血单核细胞，经过诱导和逆转，具有多能细胞特性的细胞。这种细胞的前身是外周血的单核细胞，经过特殊的去分化和扩增技术，使其生长为具有多能细胞的再生功能的新型细胞，然后回输体内，可以对组织结构和功能进行再生和修复，另外，还可以激活组织器官内处于休眠或抑制状态的前体细胞，取代并修复体内因病变而受损和失去功能的组织细胞，重新恢复建立重要生命器官的生理功能，以达到治疗各种慢性疾病和抗衰老及保健的目的。

目前，PPCs的建立是基于德国Fandrich教授的技术。该技术存在许多缺陷，例如：1.一次性抽血量达500ml左右，对个体的影响比较大；2.培养基的选择更倾向于淋巴细胞的培养，而非类干细胞的培养；3.培养基内添加了动物成份的血清。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的提供一种区别于传统培养法的人PPCs细胞的培养方法，低氧环境和成纤维细胞上清液使得PPCs细胞纯度高，生长良好，细胞增殖快，细胞得率和存活率均大大提高同时能够尽可能地避免动物成分对细胞培养的影响，为多能细胞的培养提供一种新的思路和方法。

为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：

一种快速高效的PPCs细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：使用0.1％的明胶稀释液37℃培养箱中过夜包被培养容器；

步骤2：分离单个核细胞，然后洗涤、离心并重悬；分离单个核细胞的洗涤和重悬过程，使用成纤维细胞的细胞上清液进行，优选使用成纤维细胞培养3天后的细胞上清液；

步骤3：将所述步骤1处理的培养容器内的明胶吸除，并将步骤2获得的单个核细胞接种到培养容器中，放置在氧浓度为0.5％-7％的细胞培养箱中培养。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，步骤3中的培养容器中的氧浓度为5％；

优选地，培养细胞所使用的培养基中一半体积为成纤维细胞的细胞上清液，另一半体积为包含有5-12％knockout血清替代品、0.5％双抗、0.007ul/ml b-巯基乙醇、10ng/ml SCF以及100U/ml IL-3的DMEM/F12培养基。

优选地，上述成纤维细胞的细胞上清液，是将成纤维细胞培养3天后的上清液用0.22μm滤膜过滤后获得。

优选地，上述成纤维细胞以4×10⁶/瓶接种于T75瓶中，培养基为10％knockout血清替代品的DMEM/F12培养基，在37℃下，放置于5％CO₂的培养箱中培养。

优选地，上述培养容器为细胞培养瓶或细胞培养板。